外泌体是细胞外囊泡的一类，通常由细胞通过内体相关途径形成并释放。其脂质双层膜能够包裹蛋白质、核酸和其他生物活性分子。

在siRNA递送研究中，外泌体具有一定的应用潜力，但其天然膜结构也限制了游离siRNA直接进入囊泡内部。

因此，研究人员开发了多种外泌体核酸装载方法，包括被动孵育、电穿孔、超声处理以及通过供体细胞工程化实现间接装载等。

电穿孔方法受到关注的重要原因，是其能够在不必直接进行供体细胞基因改造的情况下，对分离后的外泌体进行核酸装载研究。

但其装载效果需要通过严格实验验证，尤其应区分囊泡内部siRNA、膜表面吸附siRNA和非囊泡核酸聚集体。

电穿孔装载siRNA的基本原理

电穿孔是指在一定电脉冲条件下，脂质双层膜的结构与通透性发生暂时变化的现象。

在适宜条件下，电脉冲可能使膜形成短暂的通透区域，使外部siRNA有机会进入囊泡内部。

理想情况下，电穿孔处理后囊泡膜能够恢复一定程度的完整性，同时保留部分进入内部的siRNA。

然而，外泌体的膜结构、尺寸和组成与常规细胞存在明显差异，其对电脉冲的响应也并不完全相同。

当电穿孔条件不合适时，可能出现膜结构损伤、颗粒融合、核酸聚集及样品回收率下降等问题。

因此，电穿孔装载研究的核心目标不仅是提高核酸检测量，还应兼顾囊泡完整性、真实内部装载量和后续基因沉默活性。

核心问题：siRNA电穿孔后为什么容易出现聚集？

电穿孔过程中的聚集现象可能来自多个不同机制。它们在检测结果上可能表现相似，但对装载效率和递送性能的影响并不相同。

经典研究：电穿孔可能导致siRNA沉淀

2013年，Kooijmans等人在 Journal of Controlled Release 发表研究，指出电穿孔处理可能引起siRNA聚集，从而导致外泌体siRNA装载效率被高估。

研究发现，部分被认为与外泌体结合的siRNA，实际上可能来自电穿孔条件下形成的核酸聚集体。

这一发现对后续外泌体核酸装载研究具有重要意义：不能仅根据电穿孔后回收样品中的siRNA总量判断真实装载效率。

相关文献：

Kooijmans S A A, et al. Electroporation-induced siRNA precipitation obscures the efficiency of siRNA loading into extracellular vesicles. Journal of Controlled Release, 2013, 172(1): 229–238. DOI: 10.1016/j.jconrel.2013.08.014。

影响siRNA与外泌体聚集的关键因素

不同电穿孔体系中的聚集程度受到多种因素共同影响，包括电参数、缓冲液组成、核酸浓度及囊泡自身性质。

1 电压、电场强度及脉冲条件

电穿孔的主要参数包括电压、电场强度、脉冲持续时间、脉冲次数及脉冲波形等。

在其他条件相近时，较强的电场可能提高膜通透性，但也可能增加膜损伤、颗粒聚集和核酸沉淀的风险。

需要注意，不同电穿孔仪器的脉冲波形、输出方式和电极结构可能不同，因此不能仅根据电压数值直接比较不同研究的处理强度。

2 电穿孔缓冲液组成

缓冲液组成是影响siRNA聚集的重要因素之一。

其离子强度、电导率、pH及金属离子组成，均可能影响核酸溶解状态和囊泡膜稳定性。

例如，部分多价金属离子能够与核酸磷酸骨架发生相互作用，改变核酸分子的胶体行为。

此外，较高的缓冲液电导率可能增加电脉冲过程中的电流及焦耳热效应，进而影响样品状态。

因此，电穿孔缓冲液不仅需要适合囊泡膜处理，还应避免诱导明显的siRNA沉淀或聚集。

3 siRNA浓度与投料比例

siRNA投料浓度可能影响体系中的核酸聚集倾向。

在一定条件下，提高siRNA投料量可以增加可供装载的核酸数量，但当核酸浓度超过体系适宜范围时，可能增加聚集及后续分离困难。

因此，实验设计中应同时考察siRNA投料量、真实内部装载量及装载效率，而不是仅以核酸总回收量作为优化依据。

4 外泌体浓度与颗粒来源

不同细胞来源的外泌体具有不同的脂质和膜蛋白组成，其膜流动性、表面电荷和稳定性可能存在差异。

此外，外泌体浓度也可能影响颗粒之间的接触频率。

在较高颗粒浓度条件下，电脉冲处理过程中囊泡之间发生相互作用的机会可能增加，但具体聚集程度需要实验验证。

5 温度及电穿孔后的恢复条件

电脉冲过程中的局部温度变化可能影响膜稳定性及核酸状态。

处理结束后，囊泡膜可能经历一定的结构恢复过程，但恢复程度受到样品性质及处理条件影响。

因此，需要综合评价电穿孔前后样品的粒径、颗粒数量及膜完整性，而不能仅依据核酸装载信号判断处理是否成功。

如何区分siRNA聚集、囊泡聚集与真实内部装载？

这是评价电穿孔装载效果的关键。

1 纳米颗粒跟踪分析（NTA）

NTA可用于评价电穿孔前后样品的颗粒浓度及粒径分布。

如果处理后大粒径颗粒比例明显增加，可能提示囊泡聚集或非囊泡颗粒形成。

但NTA不能仅凭粒径区分外泌体与siRNA聚集体，因此需要配合其他检测方法。

2 动态光散射（DLS）

DLS能够提供样品水动力学粒径及多分散性信息。

当体系中出现少量大颗粒时，DLS的强度加权结果可能明显偏向较大粒径，因此适合辅助筛查聚集现象，但不宜单独用于判断颗粒组成。

3 透射电子显微镜（TEM）及冷冻电镜

TEM和冷冻电镜可用于观察电穿孔前后囊泡的形貌变化。

例如，研究人员可以观察是否存在明显的颗粒黏连、膜结构破坏或异常大颗粒。

但常规负染TEM可能引入样品干燥及染色伪影，因此应谨慎解释形貌变化。

4 核酸酶保护实验

核酸酶保护实验是判断siRNA是否受到囊泡膜保护的常用研究思路。

一般可设置以下条件：

如果siRNA位于完整囊泡内部，理论上可能受到脂质膜的保护；在膜结构被破坏后，其对核酸酶的敏感性可能增加。

但部分核酸聚集体也可能表现出一定的核酸酶耐受性，因此核酸酶保护实验应与分离纯化和结构表征结合使用。

5 荧光标记与凝胶电泳分析

对于适宜的荧光标记siRNA，可以利用荧光检测分析核酸在不同分离组分中的分布。

同时，可采用凝胶电泳观察siRNA是否存在异常迁移或聚集相关现象。

如果电穿孔后出现明显的非正常迁移或沉淀，应进一步分析其是否由缓冲液组分、核酸浓度或电脉冲处理引起。

优化策略：如何降低siRNA电穿孔装载过程中的聚集？

特别关注：聚集减少不等于装载成功

实验优化后，如果样品粒径恢复正常、siRNA沉淀减少，说明聚集问题可能得到改善。

但这并不能自动证明siRNA已经进入囊泡内部。

因此，还需要通过核酸酶保护、分离组分分析及细胞功能实验进一步验证。

实验设计：建立可靠的siRNA装载评价体系

建议将实验分为三个阶段：聚集风险筛查、装载效果验证和生物学功能评价。

第一阶段：聚集风险筛查

设置不同电穿孔条件，检测处理后siRNA单独样品及外泌体单独样品的变化。

建议至少包括以下对照：

• siRNA单独电穿孔组；

• 外泌体单独电穿孔组；

• siRNA与外泌体混合但不电穿孔组；

• siRNA与外泌体共同电穿孔组；

• 相应的缓冲液空白组。

这一设计有助于区分核酸本身的聚集、电场对囊泡的影响以及核酸与囊泡共同处理时产生的变化。

第二阶段：装载效率与颗粒质量评价

对经过纯化的样品进行颗粒浓度、粒径、形貌及siRNA定量分析。

可将表观核酸回收率定义为：

其中：

• \(\eta_{\mathrm{app}}\)：表观核酸回收率；

• \(m_{\mathrm{siRNA,recovered}}\)：纯化后样品中测得的siRNA质量；

• \(m_{\mathrm{siRNA,input}}\)：初始投入的siRNA质量。

需要强调，这一指标只能反映核酸回收情况，不能直接代表真实内部装载效率。

对于内部装载量，应结合经过验证的核酸酶保护、膜破坏和核酸定量方法进一步估算。

第三阶段：功能性递送验证

在适宜的细胞模型中，可以通过检测靶基因mRNA或蛋白质表达变化，评价装载siRNA的功能性递送效果。

如果观察到目标基因表达下降，说明该体系可能实现了功能性RNA干扰。

但还需要排除游离siRNA、非囊泡核酸聚集体及其他递送组分对实验结果的影响。

因此，功能实验应设置适当的阴性对照和游离siRNA对照。

八、从技术问题到应用发展：外泌体siRNA递送的研究趋势

随着外泌体工程化技术的发展，研究重点正在从简单提高核酸装载量，转向提高装载真实性、递送效率及工艺可重复性。

1 更加重视真实内部装载

未来研究需要明确区分囊泡内部核酸、膜表面结合核酸和非囊泡核酸聚集体。

通过多技术联合分析，可以减少电穿孔导致的假阳性装载结果。

2 更加重视囊泡结构完整性

外泌体的递送功能不仅取决于siRNA含量，还受到膜结构、表面蛋白及细胞摄取途径等因素影响。

因此，在优化电穿孔参数时，应将膜完整性和生物学功能作为重要评价指标。

3 探索替代装载与复合递送策略

对于电穿孔装载效率较低或聚集问题较严重的体系，可以探索其他装载方法。

例如，利用供体细胞工程化、核酸结合蛋白或适宜的脂质复合体系，提高siRNA与囊泡之间的关联程度。

但这些方法同样可能存在装载不均匀、非囊泡组分干扰及生物安全性问题，需要独立验证。

4 推动外泌体核酸递送的标准化

不同实验室采用的电穿孔设备、缓冲液、囊泡来源及核酸定量方法存在差异，导致研究结果难以直接比较。

因此，建立统一的实验记录、质量控制和结果报告规范，对于提高外泌体siRNA递送研究的可重复性具有重要意义。

九、总结与展望

siRNA电穿孔装载外泌体是一种具有研究价值的核酸递送技术，但电穿孔过程中可能出现核酸沉淀、囊泡聚集、膜融合及非特异性吸附等问题，影响装载效率和实验结果的准确性。

其中，siRNA聚集是需要重点关注的技术风险之一。部分核酸聚集体可能与外泌体共同被回收，使研究人员高估真实内部装载量。

因此，在实际研究中，需要从电穿孔参数、缓冲液组成、siRNA投料比例、外泌体来源及分离纯化等方面进行综合优化。

对于外泌体siRNA递送体系而言，真正重要的不是获得高的核酸检测信号，而是实现可验证的内部装载、良好的囊泡结构完整性以及可靠的基因沉默效果。

未来，随着细胞外囊泡表征技术、核酸递送材料及标准化分析方法的发展，siRNA装载外泌体有望在基因功能研究、RNA干扰及新型核酸递送系统中获得更加深入的应用。

对于瑞禧生物相关外泌体工程化及siRNA递送研究，可重点围绕电穿孔缓冲体系优化、核酸聚集控制、装载后纯化及功能性递送评价开展技术研究，为相关纳米生物材料的开发提供参考。

参考文献

1. Kooijmans S A A, et al. Electroporation-induced siRNA precipitation obscures the efficiency of siRNA loading into extracellular vesicles. Journal of Controlled Release, 2013, 172(1): 229–238. DOI: 10.1016/j.jconrel.2013.08.014.

2. Alvarez-Erviti L, et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology, 2011, 29: 341–345. DOI: 10.1038/nbt.1807.

3. Lamichhane T N, et al. Oncogene Knockdown via Active Loading of Small RNAs into Extracellular Vesicles by Sonication. Cellular and Molecular Bioengineering, 2016, 9: 315–324. DOI: 10.1007/s12195-016-0457-4.

4. Welsh J A, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. Journal of Extracellular Vesicles, 2024, 13: e12404. DOI: 10.1002/jev2.12404.