蛋白质荧光标记是生物分析和分子成像领域的重要技术手段。通过将荧光染料连接至抗体、白蛋白、多肽或其他蛋白质，可以使原本缺乏明显荧光信号的生物分子获得可检测的光学特征。

与部分可见光荧光染料相比，近红外荧光染料在适宜条件下能够降低生物组织自发荧光的影响，为细胞成像、组织观察及动物活体成像提供研究工具。

ICG具有较长波长的吸收和发射特征，其光谱表现受到溶剂、蛋白质结合状态、浓度及聚集程度等因素影响。

常见ICG染料的吸收峰位于约780 nm附近，荧光发射峰通常位于约800 nm附近，但具体峰位并非固定不变，应以实际染料产品和实验介质中的测定结果为准。

需要注意，普通ICG与ICG-NHS并不相同。

普通ICG主要通过非共价相互作用与蛋白质结合，而ICG-NHS通过引入活性酯基团，使染料能够与适宜的伯胺发生共价反应。

这种化学连接方式为构建具有一定连接稳定性的蛋白质荧光标记物提供了基础。

ICG-NHS与蛋白质的偶联反应机制

ICG-NHS属于具有活性酯官能团的近红外荧光染料。

在适宜的反应条件下，NHS活性酯能够与蛋白质中的伯胺发生亲核酰基取代反应，形成酰胺键。

蛋白质中常见的可反应伯胺主要包括赖氨酸残基侧链上的ε-氨基，以及部分蛋白质N端的α-氨基。

其简化反应过程可表示为：

该反应能够使ICG染料通过酰胺键连接至蛋白质分子。

不过，蛋白质表面不同氨基的空间位置、局部电荷环境和溶剂可及性并不相同，因此实际偶联反应通常具有一定的位点异质性。

此外，ICG-NHS在水相环境中还可能发生水解，使活性酯失去与蛋白质氨基反应的能力。

因此，蛋白质标记过程实际上存在两个相互竞争的反应：

• ICG-NHS与蛋白质伯胺发生偶联；

• ICG-NHS与水发生反应而水解。

合理控制反应条件和染料投料比例，有助于提高有效偶联比例，并减少无效染料消耗。

核心参数：如何理解染料与蛋白的摩尔比例？

在ICG-NHS蛋白质标记研究中，需要明确区分两个概念：

• 投料摩尔比（Feed Molar Ratio）：反应开始时加入的ICG-NHS分子数量与蛋白质分子数量之比。
• 实际标记度（Degree of Labeling，DOL）：经过纯化后，平均每个蛋白质分子上实际连接的染料分子数量。

这两个指标并不相同。

例如，投料比例为10:1，并不代表终每个蛋白质分子都能够连接10个ICG染料。

由于活性酯水解、氨基空间位阻、蛋白质构象以及纯化损失等因素，实际标记度通常与理论投料比例存在差异。

1 投料摩尔比的计算方法

需要注意，不同ICG-NHS产品可能具有不同的连接臂、反离子及分子量，应以具体产品说明书中的分子量为准。

2 为什么不能只关注投料摩尔比？

投料摩尔比只能反映加入体系的染料数量，无法直接说明实际偶联效率。

例如，两种不同蛋白质即使采用相同的ICG-NHS投料比例，也可能由于氨基数量和空间可及性不同而获得不同的标记度。

此外，相同标记度的蛋白质，也可能由于染料分布位置不同而表现出不同的荧光强度及生物学活性。

因此，合理的标记条件应同时考虑投料比例、实际标记度、荧光性能及蛋白质功能保持情况。

染料与蛋白比例过低或过高，会带来哪些影响？

1 染料比例过低：荧光信号可能不足

当ICG-NHS投料量较低时，能够参与偶联的染料分子数量有限，部分蛋白质可能未被标记。

这种情况下，终标记产物的平均荧光信号可能较弱，影响低浓度样品的检测灵敏度。

对于需要进行组织成像或低丰度目标检测的研究，过低的标记程度可能无法满足实验要求。

但较低的标记度也可能具有一定优势，例如减少染料对蛋白质结构和功能位点的干扰。

因此，对于功能敏感的抗体、酶或受体结合蛋白，适度降低标记程度可能有利于保持其原有生物学活性。

2 染料比例适中：有利于平衡荧光与蛋白功能

在适宜的染料投料范围内，蛋白质能够获得一定的荧光标记程度，同时尽可能减少过度修饰带来的不利影响。

对于抗体类蛋白，合理控制染料修饰程度有助于降低对抗原结合能力的潜在影响。

对于酶类蛋白，则需要关注染料是否连接至活性中心附近，或是否引起蛋白质构象变化。

因此，适中比例并不是一个固定数值，而是需要根据蛋白质类型和具体实验目标进行确定。

3 染料比例过高：可能出现荧光自猝灭

当蛋白质表面连接过多ICG染料时，染料分子之间的距离可能减小，增加染料–染料相互作用及聚集的可能性。

在某些体系中，这种相互作用可能导致荧光自猝灭，使荧光量子产率下降。

因此，染料数量增加并不一定意味着终荧光信号持续增强。

对于部分蛋白标记体系，可能出现荧光强度先增加、随后趋于平台甚至下降的现象。

此外，较高的染料修饰密度还可能改变蛋白质的表面疏水性，增加蛋白聚集或非特异性吸附风险。

不同蛋白质体系如何选择ICG-NHS投料比例？

不同蛋白质具有不同的分子量、赖氨酸分布及生物学功能，因此其适宜标记条件存在差异。

1 抗体标记：优先关注结合活性

对于IgG抗体等具有特定识别功能的蛋白质，ICG-NHS标记需要兼顾荧光强度和抗原结合能力。

如果染料修饰位点位于抗原结合区域附近，可能影响抗体与靶标之间的相互作用。

因此，抗体标记完成后，建议通过ELISA、流式细胞术或其他适宜方法评价其结合活性。

对于抗体体系，不宜单纯追求较高的标记度，而应根据成像信号和靶标结合能力共同选择良好条件。

2 白蛋白标记：关注荧光性能与分散稳定性

白蛋白具有丰富的表面官能团和较强的分子结合能力，因此常用于荧光示踪及纳米递送研究。

在ICG-NHS白蛋白偶联过程中，需要区分共价标记染料与非共价结合染料。

由于ICG本身能够与白蛋白发生非共价相互作用，即使使用ICG-NHS进行反应，纯化后样品中的部分染料信号也可能来自非共价结合组分。

因此，应通过适宜的分离分析方法验证共价偶联程度，并评价染料是否发生聚集或泄漏。

3 酶类蛋白：重点保持催化活性

对于酶类蛋白，染料连接可能影响蛋白质构象及底物结合行为。

因此，标记条件优化应将酶活性作为重要评价指标。

即使获得较强的荧光信号，如果标记导致酶活性明显下降，也可能不适合后续功能研究。

实验设计：如何筛选合适的ICG-NHS与蛋白比例？

对于尚未建立标记工艺的蛋白质，可以采用梯度筛选方式确定适宜的染料投料比例。

1 建议采用分级比例筛选

以下提供一个用于初步探索的实验设计示例：

注：上述比例仅为方法开发阶段的示例梯度，并非ICG-NHS标记所有蛋白的推荐标准，也不代表瑞禧生物具体产品的验证条件。对于小分子量蛋白、低赖氨酸蛋白或活性敏感蛋白，应调整筛选范围。

2 控制缓冲液条件

ICG-NHS偶联反应通常需要在适宜的弱碱性条件下进行，以促进部分蛋白质伯胺参与反应。

但pH过高可能增加NHS活性酯水解，并影响部分蛋白质稳定性。

因此，反应条件需要兼顾氨基反应活性和染料稳定性。

在选择缓冲液时，还应避免使用含有大量游离伯胺的组分，例如Tris缓冲液，因为这些组分可能与ICG-NHS发生竞争反应。

常见的非胺类缓冲体系可以作为研究选择，但仍需根据蛋白质稳定性及具体产品说明书进行验证。

3 控制反应时间与温度

反应时间和温度会影响偶联反应与活性酯水解之间的竞争关系。

适当延长反应时间可能增加部分染料的连接机会，但过长的反应时间也可能增加染料水解和蛋白质结构变化的风险。

因此，建议在确定投料比例的同时，对反应时间和温度进行适当筛选。

4 及时去除未结合染料

ICG-NHS标记完成后，反应体系中可能存在未反应染料、水解产物以及与蛋白质发生非共价结合的染料。

这些组分可能影响后续荧光定量和生物学实验结果。

常见纯化方法包括尺寸排阻色谱、脱盐柱、透析及超滤等。

需要注意，部分游离染料可能与蛋白质发生较强的非共价结合，因此单纯脱盐或透析不一定能够完全区分共价标记与非共价结合。

对于要求较高的研究，应结合色谱分析或其他适宜方法进一步确认标记产物的组成。

如何评价ICG-NHS蛋白质标记质量？

ICG-NHS标记成功与否，不能仅通过肉眼观察颜色变化或单一荧光强度进行判断。

建议建立包含标记度、荧光性能、蛋白结构和生物学功能的综合评价体系。

╭─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────╮

1 实际标记度（DOL）的计算

在纯化充分、光谱参数已校准的条件下，可以利用紫外–可见吸收光谱估算染料与蛋白的摩尔浓度。

其基本计算关系为：

其中：

• \(DOL\)：平均每个蛋白质分子连接的染料分子数；

• \(C_{\mathrm{Dye}}\)：样品中染料的摩尔浓度；

• \(C_{\mathrm{Protein}}\)：样品中蛋白质的摩尔浓度。

对于具有重叠吸收光谱的体系，需要对染料在蛋白检测波长处的吸收贡献进行校正。

例如，使用280 nm测定蛋白质浓度时，可能需要采用：

其中，\(CF\)为根据具体ICG-NHS染料光谱确定的校正系数。

需要注意，不同ICG-NHS衍生物的摩尔消光系数和校正系数可能不同，应采用对应产品的实测或经验证参数，不能直接套用其他荧光染料的数据。

2 荧光强度与标记度的关系

在低至适中标记度范围内，随着染料数量增加，蛋白质荧光信号可能增强。

但当染料修饰程度进一步增加时，可能出现染料聚集和自猝灭，导致荧光强度增长减缓甚至下降。

因此，在筛选ICG-NHS投料比例时，应结合荧光信号、标记度及蛋白功能共同确定适宜范围。

3 蛋白质聚集分析

较高染料修饰密度可能改变蛋白质的表面性质，增加聚集风险。

可以采用尺寸排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）、动态光散射（DLS）及其他方法评价标记前后的蛋白聚集情况。

对于抗体类蛋白，还可以通过SEC-HPLC分析单体、聚集体及部分降解组分的变化。

4 蛋白质功能评价

蛋白质标记后的功能保持情况，是判断偶联条件是否合适的重要依据。

例如：

• 对于抗体，检测抗原结合能力；

• 对于酶，检测催化活性；

• 对于受体结合蛋白，检测与靶标的相互作用；

• 对于载体蛋白，检测其分散稳定性和相关结合性能。

只有在荧光信号满足要求、蛋白质结构和功能保持良好的情况下，标记产物才更适合用于后续研究。

ICG-NHS标记蛋白的主要应用方向

1 近红外荧光抗体探针

通过将ICG-NHS连接至抗体，可以构建具有近红外荧光信号的抗体探针。

此类材料可用于探索特定抗原表达相关的荧光成像及分子识别研究。

但抗体标记后应重点验证其靶标结合能力，并评估非特异性结合及染料对抗体分布行为的影响。

2 白蛋白荧光示踪

ICG-NHS标记白蛋白可用于研究蛋白质分布、细胞摄取及相关生物界面行为。

通过荧光检测，可以辅助观察蛋白质在不同实验环境中的分布变化。

不过，荧光信号的变化可能同时受到蛋白降解、染料转移及局部光学环境影响，因此需要结合其他检测方法解释结果。

3 蛋白质功能化纳米载体

ICG-NHS标记蛋白还可以进一步与纳米颗粒、脂质体或其他递送载体结合，构建具有荧光示踪能力的复合材料。

例如，将标记蛋白作为纳米载体的表面功能组分，可以用于研究载体与细胞之间的相互作用。

此类体系需要同时考虑蛋白质标记程度、载体连接方式及终材料的荧光稳定性。

4 多模态成像与诊疗研究

ICG-NHS蛋白偶联技术还可以与其他成像材料相结合，探索多模态分子探针。

例如，通过将近红外荧光标记与其他成像功能结合，可研究不同检测方式之间的互补性。

但多模态体系的实际性能需要通过独立的成像实验和材料表征进行验证。

常见实验问题及解决思路

总结与展望

ICG-NHS是一种可用于蛋白质近红外荧光标记的活性酯染料，能够通过与蛋白质伯胺发生偶联反应，形成具有荧光信号的蛋白质标记物。

在实际研究中，染料与蛋白质的投料摩尔比是影响偶联效率的重要因素，但并不是决定终标记质量的唯一参数。

过低的染料比例可能导致标记程度不足，而过高的比例则可能增加荧光自猝灭、蛋白聚集及生物学功能下降的风险。

因此，ICG-NHS蛋白质标记的良好条件，并不是使染料连接数量达到大，而是在荧光强度、实际标记度、蛋白质稳定性和生物学活性之间实现合理平衡。

对于不同蛋白质体系，建议通过分级投料比例筛选，结合紫外–可见吸收光谱、荧光光谱、蛋白聚集分析及功能实验，建立适合具体研究目标的标记条件。

未来，随着近红外荧光材料、蛋白质偶联化学及生物成像技术的进一步发展，ICG-NHS及其功能化衍生物有望在抗体荧光探针、蛋白质示踪、纳米载体标记及多功能分子成像研究中获得更加广的应用。

参考文献与技术资料

1. Hermanson G T. Bioconjugate Techniques. 3rd Edition. Academic Press, 2013. 蛋白质氨基偶联、NHS酯反应及荧光标记技术的基础参考资料。

2. Haugland R P. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Molecular Probes. 荧光染料标记、光谱性质及染料蛋白比评价的参考资料。

3. Schaafsma B E, et al. The clinical use of indocyanine green as a near-infrared fluorescent contrast agent for image-guided oncologic surgery. Journal of Surgical Oncology, 2011, 104(3): 323–332. DOI: 10.1002/jso.21943。

4. Marshall M V, et al. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Molecular Imaging and Biology, 2010, 12: 583–594. DOI: 10.1007/s11307-010-0317-x。