随着细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）在药物递送、疾病诊断和生物医学成像等领域的研究不断深入，荧光标记技术已成为观察囊泡体内分布、细胞摄取及组织富集行为的重要手段。其中，DiR作为一种具有近红外荧光特性的亲脂性染料，因其能够与脂质膜结合，被广应用于外泌体及其他细胞外囊泡的荧光示踪研究。

然而，DiR标记外泌体的关键技术难点，并不只是提高荧光强度，而是确保检测到的荧光信号能够准确反映外泌体的分布行为。

在实际标记过程中，部分DiR分子可能未能有效结合外泌体膜，而是以游离分子、染料聚集体或其他非囊泡结合形式存在。这些残余染料可能影响荧光检测结果，甚至导致研究人员将游离染料的组织分布误判为外泌体的体内富集。

一、为什么DiR适用于外泌体荧光标记？

DiR是一种亲脂性近红外荧光染料，通常用于细胞膜标记、脂质纳米颗粒示踪及生物体内荧光成像等研究。

其分子具有疏水性结构，能够与脂质环境发生相互作用，因此可以用于外泌体等具有脂质双层膜结构的颗粒标记。

与部分可见光荧光染料相比，DiR具有较长波长的激发和发射特征，在适宜的成像条件下，可以降低部分生物组织自发荧光带来的背景干扰。

需要注意，DiR标记后获得的是带有荧光信号的囊泡相关样品，而不是能够永久追踪完整外泌体的专一性标记系统。

当外泌体膜发生降解、融合或脂质交换时，DiR信号可能转移至其他膜结构，因此荧光信号与完整外泌体之间并不存在绝对的一一对应关系。

二、游离DiR染料干扰的形成机制

DiR标记过程通常利用染料与外泌体膜之间的亲脂性相互作用实现荧光功能化。

但这一过程受到染料浓度、外泌体膜脂组成、反应介质和孵育条件等因素影响，并非所有加入体系的DiR都能够稳定结合外泌体。

为什么游离染料会影响外泌体分布判断？

在活体成像实验中，检测设备主要识别特定波段的荧光信号，而无法仅凭荧光强度区分信号究竟来自完整外泌体、游离DiR还是与其他生物组分结合的DiR。

例如，动物肝脏区域出现较强荧光信号，可能与标记外泌体的组织分布有关，也可能受到残余染料、染料转移及组织光学特性等因素影响。

因此，DiR荧光分布图应被理解为染料相关信号的空间分布，而不能直接等同于完整外泌体的真实生物分布。

三、游离DiR染料的去除：常见纯化方法与适用性比较

DiR标记完成后，需要根据样品特征选择合适的纯化方法，尽可能去除游离染料和非囊泡结合的染料聚集体，同时减少外泌体损失。

不同纯化技术在分离原理、回收效率和样品适用性方面存在明显差异。

3.1 尺寸排阻色谱：适用于温和纯化的常见选择

尺寸排阻色谱利用不同颗粒进入凝胶孔道能力的差异实现分离。

在适宜的色谱体系中，外泌体通常较早洗脱，而较小的游离染料分子可能进入凝胶孔道并在后续组分中洗脱。

这种方式有助于降低游离小分子染料的残留，并减少强机械处理对囊泡结构的影响。

但对于DiR等亲脂性染料，部分聚集体或染料–蛋白复合物的水动力学尺寸可能与外泌体接近，因此仅通过SEC并不能保证完全去除所有非囊泡荧光组分。

实验中建议分别检测各洗脱组分的颗粒浓度、荧光信号和蛋白质含量，确定适合收集的组分范围。

3.2 超速离心：需要关注共沉降风险

超速离心是细胞外囊泡研究中常用的分离和浓缩方法。

对于DiR标记样品，超速离心可能使部分外泌体沉降，并通过去除上清液降低部分未结合染料的含量。

但是，染料聚集体或其他非囊泡颗粒也可能在相同条件下发生沉降。

因此，离心后获得荧光沉淀，并不能直接证明染料已成功插入外泌体膜。

此外，反复离心可能导致囊泡回收率下降、颗粒聚集或膜结构变化，应根据样品特点控制处理过程。

3.3 超滤与组合纯化策略

超滤能够利用一定分子量截留范围的膜材料，对外泌体样品进行浓缩及缓冲液置换。

对于游离小分子DiR，超滤可能实现一定程度的分离，但由于DiR的疏水性和聚集行为，实际去除效果可能与简单的分子量预测不同。

在对样品纯度要求较高的研究中，可以考虑将SEC与超滤等方法组合使用。

例如，先通过SEC分离主要游离染料，再采用经过验证的超滤条件对外泌体组分进行浓缩。

组合纯化的目的不是增加处理步骤本身，而是提高样品纯度，同时将囊泡损失控制在可接受范围内。

四、关键控制策略：从标记条件到纯化验证

为了降低游离DiR染料的干扰，需要将质量控制贯穿整个标记过程，而不是仅在标记结束后进行简单洗涤。

4.1 优化染料投料比例

DiR浓度过低时，可能无法提供足够的荧光检测信号；浓度过高则可能增加游离染料残留及颗粒聚集风险。

因此，建议以外泌体颗粒数或经过验证的膜脂含量作为归一化依据，设置不同染料投料梯度。

通过比较纯化后的荧光强度、颗粒回收率和染料空白背景，选择能够满足检测要求且背景较低的条件。

4.2 控制孵育时间与反应介质

孵育时间会影响DiR与外泌体膜的接触和结合过程。

过短的孵育可能导致标记不足，过长则不一定持续提高有效标记程度，还可能增加颗粒聚集及其他不利变化。

此外，反应介质中的蛋白质、脂蛋白或其他疏水组分可能与DiR发生结合，形成额外的荧光背景。

因此，应根据外泌体来源和样品组成选择合适的反应体系，并避免将某一标记条件直接应用于所有来源的囊泡。

4.3 设置完整的实验对照

合理的对照实验是区分真实囊泡相关荧光与染料干扰的重要手段。

建议至少设置以下分组：

国际细胞外囊泡学会发布的MISEV2023指南明确强调，荧光标记研究需要设置染料单独处理对照，并验证标记及纯化步骤是否引入非囊泡信号或改变囊泡性质。

五、质量评价：如何判断游离染料是否得到有效控制？

评价DiR标记外泌体的质量，应同时关注染料去除效果、颗粒结构完整性和荧光信号可靠性。

5.1 通过荧光背景比较评价纯化效果

在统一的检测条件下，可以将经过相同纯化处理的DiR空白组与标记EV组进行比较。

例如，可定义表观背景信号比例：

其中：

• \(F_{\mathrm{blank}}\)：经过相同纯化流程的DiR空白组背景校正荧光信号；

• \(F_{\mathrm{EV}}\)：DiR标记外泌体组的背景校正荧光信号。

该指标可用于特定实验条件下的组间比较，但并不等同于游离染料质量百分比，也不能直接证明染料全部结合于外泌体膜。

由于DiR荧光强度受到聚集状态和局部环境影响，建议结合色谱或其他定量方法进一步分析染料残留。

5.2 颗粒粒径变化分析

标记前后可以采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）等技术评价粒径分布及颗粒浓度。

如果标记后出现明显的大颗粒群体，可能提示囊泡聚集、染料聚集体形成或其他非囊泡颗粒增加。

但粒径分布没有明显变化，也不能单独证明不存在游离染料干扰。

因此，粒径检测应与荧光信号分离分析共同使用。

5.3 单颗粒荧光检测

在具备适宜仪器条件的情况下，可采用纳米流式细胞术、单颗粒荧光检测或其他高分辨分析方法，研究荧光信号与颗粒事件之间的关联。

但单颗粒荧光阳性事件也可能来自染料聚集体，因此需要设置相同处理条件的染料空白组，并结合颗粒标志物检测。

2026年发表于 Journal of Extracellular Vesicles 的研究讨论了不同荧光染料及纯化策略对EV标记结果的影响，指出荧光检测结果不仅受到染料化学性质影响，还与囊泡生物来源和分离方法密切相关。

六、活体成像研究：如何降低DiR残留导致的假阳性？

DiR标记外泌体常被用于动物活体荧光成像，以观察给药后不同时间点的荧光分布情况。

但在体内环境中，DiR可能与血浆蛋白、脂蛋白或细胞膜发生相互作用，因此需要谨慎解释成像结果。

6.1 不能仅凭荧光富集判断外泌体靶向性

在肿瘤组织或特定器官中观察到较强的近红外荧光，并不能直接证明完整外泌体在该部位实现了特异性靶向富集。

荧光信号可能受到多种因素影响，包括残余染料的分布、外泌体膜降解、染料向其他膜结构转移，以及组织对光信号的吸收和散射。

因此，在研究外泌体的体内分布时，应尽可能结合组织切片、细胞定位、独立标记方式及其他检测证据进行验证。

6.2 动物成像实验的对照设计

建议在经过伦理审批的动物实验中，设置未标记EV组、DiR标记EV组以及经过完全相同纯化流程的DiR空白组。

必要时还可采用不同的标记策略进行交叉验证，以减少单一荧光检测方式带来的偏差。

此外，应在统一的激发光、发射滤光片、曝光条件和图像分析参数下进行比较，避免因设备设置差异导致荧光强度不可比。

6.3 结合离体器官成像与组织分析

离体器官荧光成像可以辅助观察不同组织中的染料相关信号，但仍不能独立证明完整外泌体的存在。

因此，建议结合组织切片分析和适宜的囊泡相关标志物检测，进一步评价荧光信号与细胞或组织结构之间的关系。

对于要求较高的生物分布研究，还可考虑采用遗传编码报告蛋白、放射性标记或多模态成像等方法作为补充。

七、常见实验问题与优化方向

八、行业研究趋势：从提高荧光强度转向提高信号可信度

随着细胞外囊泡研究的不断发展，荧光标记技术的评价重点正在从单纯追求较高的荧光强度，转向对信号来源、标记稳定性及检测结果可重复性的综合评价。

近年来，相关研究更加关注亲脂性染料形成非特异性颗粒的问题，以及不同纯化方法对检测结果的影响。

2025年发表于 Journal of Extracellular Vesicles 的研究通过优化标记缓冲条件，减少了PKH26标记过程中非特异性颗粒的形成。这项研究虽然并非针对DiR，但说明了染料聚集及反应介质优化在细胞外囊泡荧光标记研究中的重要性。

未来，DiR标记外泌体的技术发展可重点关注以下方向：

• 标准化标记工艺： 建立以颗粒浓度、染料投料比例和纯化条件为核心的操作与评价体系。

• 多技术联合验证： 结合SEC、NTA、单颗粒荧光分析和其他表征方法，提高检测结果的可靠性。

• 降低非特异性背景： 通过优化染料浓度和介质组成，减少游离染料及染料聚集体的形成。

• 多模态示踪研究： 将荧光检测与其他独立标记策略结合，降低单一染料示踪的局限性。

对于瑞禧生物相关DiR荧光标记材料的科研应用，建立完善的游离染料控制方法及质量评价流程，有助于提高细胞外囊泡荧光示踪实验的可重复性，并为相关生物成像研究提供更加可靠的技术基础。

参考文献

1. Welsh J A, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. Journal of Extracellular Vesicles, 2024, 13: e12404. 

2. Studying exogenous extracellular vesicle biodistribution by in vivo fluorescence microscopy. Journal of Cell Science, 2023. 

3. Advances in Analysis of Biodistribution of Exosomes by Molecular Imaging. 2020. 

4. Haines et al. Non-Specific Particle Formation During Extracellular Vesicle Labelling With the Lipophilic Membrane Dye PKH26. Journal of Extracellular Vesicles, 2025. 

5. Vrdoljak P, et al. No Dye Fits All: Illuminating the Challenges of Fluorescent Extracellular Vesicle Labeling. Journal of Extracellular Vesicles, 2026.