产品说明

DBCO-PEG-HRP是基于无铜点击化学设计的功能化酶偶联物，由二苯并环辛炔（DBCO）、亲水PEG连接臂、辣根过氧化物酶（HRP）三部分共价结合而成，属于预标记完成的点击化学酶探针。DBCO是经典应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）反应基团，不需要铜离子催化，在生理条件下直接和叠氮（-N3）标记的分子、材料发生点击反应，生成稳定三唑环；PEG链作为间隔臂，降低DBCO的疏水性，减少HRP蛋白和底物之间的空间位阻，同时降低非特异性吸附，保护HRP酶活性不被修饰过程破坏。HRP是应用很广的标记酶，在H₂O₂存在条件下，可以催化TMB、DAB、鲁米诺等底物显色或者发光，用于ELISA、免疫印迹、荧光成像、化学发光检测。

该产品多为冻干粉或者水溶液，外观淡黄色，水溶性优秀；核心优势是无需额外酶标记步骤，直接通过点击化学标记叠氮修饰靶点，规避传统交联剂对酶活性的损伤，无铜体系对活细胞、生物样品毒性低。对比游离HRP，DBCO-PEG-HRP可以精准定点标记叠氮修饰位点，实现位点特异性标记，而不是随机氨基标记，标记可控性更强，适合复杂生物体系、活细胞标记、胞外囊泡标记、原位成像等方向。产品纯度满足生化检测、细胞成像实验，酶活保留率高，是无铜点击化学与免疫酶检测结合的核心探针。 

产品应用
第一，无铜点击化学介导的免疫标记、原位生物成像。对叠氮修饰的细胞、细胞膜蛋白、胞外囊泡进行标记，利用HRP催化显色/发光，在细胞、组织切片上实现原位可视化，不产生铜离子毒性，适合活细胞体系。
第二，点击化学ELISA、化学发光检测体系构建。将捕获抗体、抗原预先叠氮修饰，再用DBCO-PEG-HRP点击偶联，建立新型夹心检测方案，用于蛋白标志物、外泌体、核酸的定量检测。
第三，WB、免疫组化的点击标记探针。传统HRP二抗依靠氨基随机偶联，本试剂可以定点标记叠氮化一抗，减少标记对抗体结合活性的影响，降低背景信号。
第四，纳米材料、微球、芯片表面标记。叠氮修饰磁性微球、二氧化硅微球、传感芯片，通过SPAAC反应固定HRP，构建酶固定化传感阵列，用于生物检测。
第五，糖代谢标记研究。利用代谢糖工程给细胞表面糖蛋白带上叠氮基团，再用DBCO-PEG-HRP标记，追踪细胞表面糖基化动态变化，糖组学基础研究。
第六，外泌体标记与示踪。外泌体膜上叠氮修饰后，偶联DBCO-PEG-HRP，通过酶促发光信号追踪外泌体细胞摄取、胞内转运过程。
第七，水凝胶、生物支架的酶功能化。叠氮修饰水凝胶网络，点击固定HRP，构建催化活性支架，用于生物传感、可控催化体系。

使用方法
复溶：冻干粉使用无酶纯水或者推荐储存缓冲液轻柔复溶，禁止剧烈涡旋震荡，高速震荡会造成HRP变性失活。
反应体系：底物为叠氮修饰样品（蛋白、细胞、纳米材料、切片），缓冲液推荐PBS、HEPES，pH 7.0–8.0，严禁加入叠氮钠，叠氮钠会直接抑制HRP活性。
点击反应：按照DBCO-PEG-HRP和叠氮底物摩尔比2:1~5:1投料，室温避光孵育2–6 h；细胞标记体系可延长至4℃过夜。
洗涤去除游离探针：蛋白样品用透析脱盐；细胞、组织切片用PBS多次漂洗；纳米颗粒离心洗涤，去除未反应DBCO-PEG-HRP，降低背景。
酶促显色/发光：加入H₂O₂和对应的底物（TMB、DAB、鲁米诺），按照HRP标准检测流程显色、采集信号。
对照设置：设置不含叠氮基团的阴性对照，排除非特异性吸附带来的背景信号。
样品保存：标记完成的样品尽快检测，不建议长时间放置；未使用的母液分装避光，低温保存。

注意事项
HRP对叠氮钠高度敏感，所有缓冲液、底物溶液中禁止添加叠氮钠防腐剂，会直接造成酶活不可逆丧失。酶蛋白不耐高温、剧烈震荡，复溶、转移操作轻柔，避免吹打产生大量气泡。DBCO点击反应不需要铜离子，体系不要添加铜催化剂，铜离子不仅损伤细胞，也会影响HRP活性。避免强还原剂、高浓度去污剂，SDS高浓度会造成HRP变性。干粉避光-20℃保存，水溶液短期4℃避光，长期分装冻存，避免反复冻融。标记时控制孵育浓度，过高浓度会带来非特异性吸附，背景升高。本产品仅用于科研体外实验，不用于临床诊断试剂盒。操作时防止蛋白溶液污染，使用无酶耗材。废弃酶溶液按照生化废液处理。如果需要长时间孵育活细胞体系，控制探针浓度，减少非特异性吸附。