作者：

Ying Qu a , Ang Li b , Long Ma c , Sajid Iqbal a , Xiao Sun a , Wenqing Ma a , Chunyan Li a ,

Dandan Zheng a , Zixuan Xu a , Zhongxi Zhao a,* , Dedong Ma d,

引用瑞禧生物产品：

DSPE-PEG 2000 ,Cy5.5

1 引言

胶质母细胞瘤是成人中枢神经系统中预后较差的恶性肿瘤类型之一，现有标准治疗方案下患者的生存期延长空间仍然有限。造成这一现状的核心原因，一方面在于血脑屏障这一由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞终足和周细胞共同构成的生理性屏障，可阻挡绝大多数外源性分子进入脑实质，导致经静脉给药的药物难以在肿瘤区域达到有效作用浓度；另一方面，GBM肿瘤细胞自身可通过多药耐药蛋白上调、DNA损伤修复通路激活等机制，降低化疗药物的作用效果，终导致治疗后肿瘤快速复发。

长期以来，研究者围绕突破血脑屏障限制开展了大量递送系统探索，包括受体介导的跨内皮转运、血脑屏障瞬时开放、颅内植入给药等不同策略，但多数方案仍存在操作侵入性强、体内分布选择性不足或安全性风险较高等问题。鼻至脑给药路径依托鼻腔与脑部之间存在的嗅觉神经通路与三叉神经通路，可使递送系统直接从鼻腔黏膜进入颅内，无需经过体循环的稀释与代谢，为脑靶向递送提供了一种非侵入性的可行方案。

双硫仑作为一种已在临床使用多年的药物，近年被发现在肿瘤相关研究中可展现出特定的生物学活性，尤其在与铜离子共存时，二者可形成具有特定结构的复合物，进而对肿瘤细胞的多种生命活动产生影响。然而游离DSF经常规途径给药后存在体内稳定性不足、脑内递药效率低等问题，难以在颅内维持足够的作用浓度。因此，构建一种可经鼻腔给药、同时实现DSF稳定包载与可控释放的纳米递送系统，对提升DSF/Cu在脑内的有效暴露量具有实际意义。

为直观验证该纳米乳剂原位凝胶载体的脑内递送效率，本研究引入瑞禧生物提供的近红外荧光标记磷脂衍生物DSPE-PEG2000-Cy5.5，对INEG载体进行荧光功能化修饰。该分子的近红外光学特性可有效降低生物组织自发荧光的干扰，实现活体层面的脑内分布动态可视化，为直接证实该鼻脑递送系统的靶向效能提供关键的实验依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

本研究中使用的核心荧光标记材料信息如下：

• 中文名称：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[聚乙二醇2000]-Cyanine 5.5荧光染料修饰物

• 英文名称：DSPE-PEG2000-Cy5.5

• 别称：Cy5.5-PEG-DSPE、DSPE-PEG-Cy5.5（PEG2000） 该材料由瑞禧生物提供，外观为深紫色至蓝紫色粉末，大吸收峰约675 nm，大发射峰约695–700 nm，可溶于氯仿、DMSO、甲醇等有机溶剂，适合用于脂质类纳米载体的近红外荧光标记与活体示踪。

其他主要试剂包括：双硫仑、硫酸铜、注射用大豆油、乳化剂、离子敏感凝胶基质、C6大鼠胶质瘤细胞、U87人胶质瘤细胞、GFP稳定转染的U87细胞株、SPF级SD大鼠等。所有细胞培养相关试剂均为细胞培养级，动物实验操作经机构动物伦理委员会审核通过。

2.2 DSF-INEG的制备与表征

采用高速剪切-高压均质法制备负载DSF的纳米乳剂，随后将其与离子敏感凝胶基质混合，得到离子敏感纳米乳剂原位凝胶DSF-INEG。简要步骤为：将处方量的油相、乳化剂与DSF共同溶解，在高速搅拌条件下缓慢加入水相，初乳形成后转移至高压均质机中，在特定压力下循环均质数次，得到粒径均一的纳米乳剂。随后将该纳米乳与凝胶基质按比例混合，室温下搅拌均匀，即得到可在鼻腔生理离子环境下发生原位胶凝的DSF-INEG制剂。

采用动态光散射粒度仪测定制剂的平均粒径与粒径分布，采用电泳光散射法测定其ζ电位；通过倒置试管法考察制剂在37℃模拟鼻腔离子环境下的凝胶化转变时间；采用动态透析法评价DSF在体外不同介质中的释放行为，连续取样并通过高效液相色谱法测定不同时间点的DSF浓度，绘制体外释放曲线。

2.3 Cy5.5标记INEG示踪制剂的制备

参照脂质载体膜嵌入标记方法，将处方比例的DSPE-PEG2000-Cy5.5与其他油相组分共同溶解于有机溶剂中，在纳米乳制备过程中直接整合进入纳米乳的脂质相结构，终得到荧光标记的Cy5.5-INEG制剂。该标记方式可依托DSPE脂质尾部的疏水锚定作用，将Cy5.5荧光基团稳定展示在纳米颗粒表面的PEG亲水层末端，避免游离染料泄漏对后续成像结果产生干扰。标记完成后，通过紫外-可见分光光度计验证Cy5.5的特征吸收峰，确认标记过程未对染料的光学性质产生明显影响。

2.4 体外细胞抑制实验

取处于对数生长期的C6与U87胶质瘤细胞，以适宜密度接种于96孔细胞培养板中，培养24 h后分别加入不同浓度梯度的游离DSF/Cu溶液与DSF-INEG/Cu体系，继续孵育特定时间后，采用CCK-8法测定各孔的细胞活力，计算不同处理组对两种胶质瘤细胞的增殖抑制率，评价DSF-INEG/Cu的体外作用效果。

2.5 大鼠鼻内给药与脑组织荧光分布观察

将健康SD大鼠随机分组，经鼻腔途径给予等体积的Cy5.5-INEG制剂，在给药后不同时间点通过小动物活体近红外成像系统观察大鼠头部区域的荧光分布动态变化。在设定的时间点处死后分离全脑组织，进行离体脑片成像与主要器官成像，定量分析不同脑区的荧光信号强度，直接验证INEG载体经鼻给药后的脑靶向分布特征。

2.6 颅内胶质瘤模型治疗与生存评价

采用立体定位注射法将GFP稳定转染的U87胶质瘤细胞接种于大鼠右侧脑尾状核区域，建立大鼠颅内GBM模型。待接种后第7天将造模大鼠随机分为空白对照组、游离DSF/Cu治疗组与DSF-INEG/Cu治疗组，各组均经鼻腔途径给予相应处理，按设定给药频率持续干预。采用活体GFP荧光成像系统连续监测颅内肿瘤的荧光信号变化，评价肿瘤生长趋势；记录各组大鼠的生存时间，绘制生存曲线，统计中位生存时间。治疗周期结束后，取大鼠主要正常器官进行组织病理学切片与HE染色，观察是否存在明显病理形态改变。

3 结果与分析

3.1 DSF-INEG的基本理化性质表征

本研究制备得到的DSF-INEG外观为均一的半透明乳状分散体系，经动态光散射测定其平均粒径为63.4 ± 1.1 nm，ζ电位为–23.5 ± 0.2 mV。该粒径范围有利于纳米乳在鼻腔黏膜纤毛间隙中扩散，同时在原位凝胶形成后可被稳定包裹在凝胶网络中，延缓药物快速清除。负电性的ζ电位可减少纳米颗粒之间的聚集倾向，提升制剂在储存过程中的物理稳定性。

倒置试管法结果显示，DSF-INEG在室温下为可流动的液态，当置于37℃含有适宜离子浓度的模拟鼻腔介质中时，可在设定时间内完成溶胶-凝胶转变，形成半固体状原位凝胶，该特性可保证制剂经鼻腔滴入后，在鼻腔黏膜表面快速发生胶凝，减少药液因鼻腔纤毛清除作用快速流失，延长制剂在鼻腔作用部位的滞留时间。体外释放结果显示，DSF-INEG在释放介质中可实现长达数小时的持续药物释放，无明显突释现象，该释放行为有助于维持局部药物浓度的平稳，减少短时间内药物浓度波动带来的潜在刺激。

3.2 体外胶质瘤细胞增殖抑制效果

CCK-8实验结果显示，在相同DSF当量浓度条件下，DSF-INEG/Cu体系对C6与U87两种胶质瘤细胞的增殖均呈现出浓度依赖性的抑制作用。随着共孵育时间的延长，细胞活力进一步降低，提示该递送系统可将DSF与Cu有效递送至肿瘤细胞内部，发挥对应的生物学作用。与同等浓度的游离DSF/Cu组相比，DSF-INEG/Cu在特定浓度区间内展现出相当的细胞抑制活性，说明纳米包载过程未对DSF/Cu的相关活性产生明显影响。

3.3 基于DSPE-PEG2000-Cy5.5的脑靶向分布验证

经鼻腔给予Cy5.5-INEG后，小动物活体成像结果显示，大鼠头部区域的近红外荧光信号随时间延长逐渐增强，在特定时间点达到峰值。离体全脑成像结果进一步显示，Cy5.5-INEG在脑组织中呈现出显著高于其他主要器官的荧光信号强度，证实INEG载体可通过鼻至脑通路有效递送至颅内，在脑内实现较高水平的分布。该结果直接从可视化层面证明，本研究构建的离子敏感纳米乳剂原位凝胶系统，可依托鼻腔通路有效突破常规递送系统难以进入颅内的限制，为后续脑内肿瘤区域的药物富集提供了直接的实验证据。

3.4 体内抗肿瘤效果与安全性评价

GFP活体荧光成像结果显示，空白对照组大鼠颅内肿瘤的绿色荧光信号随时间快速增强，提示肿瘤处于快速生长状态；游离DSF/Cu治疗组的肿瘤荧光信号增长速度有所减缓，但仍呈现明显的肿瘤进展趋势；而DSF-INEG/Cu治疗组的颅内GFP荧光信号增长幅度显著降低，肿瘤生长进程得到明显延缓。生存统计结果显示，空白对照组大鼠的中位生存时间为【待补充】天，游离DSF/Cu治疗组的中位生存时间为【待补充】天，DSF-INEG/Cu治疗组的中位生存时间为【待补充】天，分别达到空白对照组的1.6倍与游离DSF/Cu组的1.2倍。主要脏器的HE染色病理切片结果显示，各组大鼠的心、肝、脾、肺、肾组织均未观察到明显的炎性浸润、组织坏死或病理性结构改变，提示该鼻内给药系统在当前实验条件下未表现出明显的全身毒性。

4 讨论

本研究针对胶质母细胞瘤临床递送的核心难点，选择鼻至脑这一非侵入性给药路径，将双硫仑与铜离子共同包载于离子敏感纳米乳剂原位凝胶中，构建得到DSF-INEG/Cu鼻内递送系统。该制剂一方面可依托纳米乳的小粒径特性，促进其在鼻腔黏膜中的渗透，另一方面可利用离子敏感原位凝胶的相变特性，延长制剂在鼻腔给药部位的滞留时间，减少药液快速流失，为药物经鼻脑通路转运进入颅内提供充足的时间窗口。

在脑靶向效能验证环节，本研究选择DSPE-PEG2000-Cy5.5作为近红外荧光示踪探针，其Cy5.5荧光基团的发射波长处于近红外窗口，相较于传统可见光荧光染料，可大幅降低生物组织自发荧光带来的背景干扰，提升活体成像的信噪比。同时，该探针的DSPE疏水尾部可稳定嵌入纳米乳的脂质结构中，PEG链段则为纳米颗粒提供了良好的水溶性与空间稳定性，避免标记过程对纳米载体的体内分布行为产生明显干扰，终实现了INEG载体在大鼠脑内分布过程的直观可视化，为证明该递送系统的脑靶向能力提供了直接的影像学证据。

从整体实验结果来看，DSF-INEG/Cu经鼻内给药后，可在颅内实现有效的药物递送，进而延缓胶质瘤的体内生长进程，延长荷瘤大鼠的生存时间，同时未观察到明显的全身正常组织损伤。该结果为后续进一步优化载体处方、延长药物颅内滞留时间以及拓展该递送系统在其他中枢神经系统疾病研究中的应用提供了实验基础。

5 结论

本研究成功构建了粒径均一、具备离子响应性凝胶化能力与持久药物释放特性的DSF-INEG纳米乳原位凝胶系统。借助DSPE-PEG2000-Cy5.5的近红外荧光示踪功能，直接证实了该载体经鼻内给药后具备良好的脑靶向分布能力。体内外实验结果共同表明，DSF-INEG/Cu可有效抑制胶质瘤细胞增殖，显著延缓颅内肿瘤生长，延长荷瘤大鼠的中位生存时间，同时具备较好的生物相容性。该研究提示，DSF-INEG/Cu作为一种可经非侵入性鼻内给药的纳米药物递送系统，在胶质母细胞瘤的靶向干预研究中具有潜在的应用价值。

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Glioblastoma (GBM) is a difficult-to-treat cancer, likely attributed to the blood brain barrier and drug resistance. Nose-to-brain drug delivery is a direct and non-invasive pathway for brain targeting with low systemic toxicity. Disulfiram (DSF) has shown its effectiveness against GBM, especially with copper ion (Cu). In this work, we designed a DSF loaded ion-sensitive nanoemulsion in situ gel (DSF-INEG) that was delivered intranasally along with Cu to the rat brains for the GBM treatment. The developed DSF-INEG nanomedicine showed a suitable particle size of 63.4 ± 1.1 nm and zeta potential of –23.5 ± 0.2 mV with a favorable gelling ability and prolonged DSF release. The results in vitro indicate DSF-INEG/Cu effectively inhibited the proliferation of both C6 and U87 cells. Besides, the excellent brain-targeting efficacy via nose-to-brain delivery was proved by the highest fluorescence signal of Cy5.5-INEG in the rat brains. Moreover, GFP imaging showed enhanced tumor growth inhibition of the rats by the DSF-INEG/Cu treatment, and their median survival time was 1.6 and 1.2 folds than those of the rats in the control and DSF/Cu treated groups, respectively, with no obvious histopathological damage to normal tissues. Overall, DSF-INEG/Cu could be a promising intranasal nanomedicine for effective GBM treatment.