文献作者： Qiang Yang、Yanghao Zhou、Jin Chen、Ning Huang、Zhigang Wang、Yuan Cheng 等

瑞禧生物相关产品：

  • DSPE-PEG2000

  • DSPE-PEG2000-cRGD

  • DSPE-PEG2000-Biotin

引用瑞禧生物产品： (DSPE-PEG2000), DSPE-PEG2000-cRGD and DSPE-PEG2000-Biotin

一、研究背景

胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是一种侵袭性较强的恶性脑肿瘤，其治疗效果受到血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）及肿瘤细胞耐药机制的双重限制。替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）是临床治疗GBM的重要化疗药物，但部分肿瘤细胞可通过高表达O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）修复药物诱导的DNA损伤，从而降低对TMZ的敏感性，影响治疗效果。

近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术凭借其精准调控靶基因的能力，为肿瘤耐药机制干预提供了新的研究方向。然而，如何将CRISPR/Cas9系统安全、高效地递送至脑部肿瘤组织，仍是制约其体内应用的重要难题。

针对这一挑战，研究人员设计了一种经环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（cRGD）修饰的脂质-聚合物杂化纳米颗粒（LPHNs-cRGD），用于装载靶向MGMT的CRISPR/Cas9质粒。同时，结合聚焦超声（FUS）与微泡（MBs）技术，实现血脑屏障的局部、非侵入性开放，以提高基因载体向脑肿瘤区域的递送效率。

二、研究方法

本研究以脂质-聚合物杂化纳米颗粒为基础，构建具有肿瘤靶向能力的基因递送体系，并通过聚焦超声辅助增强其在脑部肿瘤组织中的富集。

首先，研究人员制备了cRGD功能化的LPHNs，并将靶向MGMT的CRISPR/Cas9质粒（pCas9/MGMT）包载于纳米颗粒中。通过粒径分析、Zeta电位测定、荧光成像及透射电子显微镜（TEM）等方法，对载体的理化性质与微观形貌进行表征。

随后，采用DNase I降解实验评价纳米颗粒对质粒DNA的保护能力，并通过体外细胞实验考察其靶向摄取、基因转染及MGMT表达调控效果。

在动物实验中，研究人员进一步将纳米递送系统与微泡及聚焦超声技术相结合，利用FUS-MBs诱导血脑屏障局部开放，促进载体进入原位胶质母细胞瘤组织，并评估其与TMZ联合治疗后的抗肿瘤效果、生存获益及生物安全性。

三、研究结果与分析

1. 成功构建具有良好稳定性的靶向纳米递送载体

研究成功制备了负载pCas9/MGMT的LPHNs-cRGD纳米颗粒。理化表征结果显示，该递送体系具有明确的纳米尺度结构和脂质-聚合物复合特征。

DNase I降解实验进一步表明，质粒经纳米颗粒包载后能够获得有效保护，降低核酸在酶作用下发生降解的风险，为后续基因递送提供了基础。

2. cRGD修饰增强肿瘤细胞靶向递送能力

通过引入cRGD靶向配体，纳米颗粒能够更有效地作用于胶质母细胞瘤细胞，促进pCas9/MGMT进入靶细胞。

体外研究发现，该递送体系能够介导CRISPR/Cas9质粒转染，并降低MGMT的表达水平。由于MGMT与TMZ耐药密切相关，其表达下调有助于提高胶质母细胞瘤细胞对TMZ的敏感性。

3. 聚焦超声联合微泡促进纳米颗粒跨越血脑屏障

血脑屏障是脑部药物及基因递送的重要生理障碍。研究利用FUS-MBs技术，在特定脑部区域实现血脑屏障通透性的暂时性增加，从而改善纳米颗粒进入肿瘤组织的条件。

实验结果显示，微泡辅助的LPHNs-cRGD递送体系结合聚焦超声处理后，能够促进纳米颗粒在原位胶质母细胞瘤区域的积聚，提升脑部肿瘤靶向递送效果。

4. 基因编辑联合化疗增强抗肿瘤效果

在原位胶质母细胞瘤小鼠模型中，FUS辅助的MBs-LPHNs-pCas9/MGMT-cRGD递送策略与TMZ联合应用后，表现出更明显的抗肿瘤作用。

研究观察到，该联合治疗方案能够有效抑制肿瘤生长，并延长荷瘤小鼠的生存时间。同时，实验结果显示该体系具有较好的生物安全性，为后续研究提供了实验依据。

四、纳米颗粒的理化性质及结构表征

纳米颗粒的特性分析

（A）LPHNs-cRGD的粒径分布，用于分析纳米颗粒的尺寸特征。

（B）LPHNs-cRGD的Zeta电位，反映颗粒表面电荷性质。

（C）DiI荧光染料标记的LPHNs-cRGD荧光图像，用于观察纳米颗粒的荧光标记情况。

（D–E）LPHNs-cRGD的透射电子显微镜图像，展示纳米颗粒的微观形貌及脂质-聚合物复合结构。其中，白色箭头分别标示脂质外层与聚合物核心。

（F）LPHNs-cRGD对pCas9/MGMT质粒的DNase I酶降解保护实验。泳道1为DNA分子量标准；泳道2为未经处理的游离pCas9/MGMT；泳道3为经DNase I处理3分钟的游离质粒；泳道4–8分别为经DNase I处理3分钟、15分钟、30分钟、1小时和2小时后，从LPHNs-cRGD中提取的质粒DNA。

该组实验从粒径、电位、形貌及核酸保护性能等多个方面验证了纳米递送体系的基本特征，为其在基因治疗中的应用提供了表征依据。

五、瑞禧生物相关材料及应用价值

在脂质-聚合物杂化纳米递送系统的研究中，功能化磷脂-聚乙二醇材料能够用于纳米颗粒表面修饰、界面结构构建及靶向功能设计。

DSPE-PEG2000

DSPE-PEG2000由磷脂结构与聚乙二醇链段组成，可用于脂质纳米颗粒及脂质-聚合物复合载体的表面修饰。PEG链段能够改善纳米体系的亲水性及胶体稳定性，并有助于优化其生物界面性质。

DSPE-PEG2000-cRGD

DSPE-PEG2000-cRGD在磷脂-PEG结构末端引入cRGD靶向肽，可用于构建具有整合素识别能力的功能化纳米载体。在适当的受体表达条件下，该材料有助于增强纳米颗粒与靶细胞的相互作用，为肿瘤靶向药物及核酸递送研究提供材料基础。

DSPE-PEG2000-Biotin

DSPE-PEG2000-Biotin是一种末端带有生物素基团的功能化磷脂材料，可通过生物素-亲和素相互作用用于纳米颗粒表面功能组装、分子偶联及相关复合递送体系的设计。

上述材料可为脂质-聚合物杂化纳米颗粒的功能化设计提供不同的修饰选择，在肿瘤靶向递送、核酸载体构建及多功能纳米平台开发等方向具有研究应用价值。

六、研究结论与展望

本研究通过构建cRGD修饰的脂质-聚合物杂化纳米颗粒，实现了靶向MGMT的CRISPR/Cas9质粒递送，并结合聚焦超声与微泡技术改善血脑屏障通透性，增强基因载体在胶质母细胞瘤组织中的积聚。

研究结果表明，该策略能够降低MGMT表达，提高肿瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，并在动物模型中表现出抑制肿瘤生长、延长生存期的潜力。

这一研究为克服胶质母细胞瘤化疗耐药及脑部基因递送障碍提供了新的实验思路，同时也体现了功能化脂质材料在靶向纳米递送系统构建中的应用价值。

需要指出的是，该研究仍处于临床前阶段，其长期安全性、基因编辑脱靶风险及临床转化可行性仍需进一步验证。

 

文献摘要

Background: Therapy for glioblastoma (GBM) has always been very challenging, not only because of the presence of the blood-brain barrier (BBB) but also due to susceptibility to drug resistance. Recently, the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)associated protein 9 (CRISPR/Cas9)  has revolutionized gene editing technology and is capable of treating a variety of genetic diseases, including human tumors, but there is a lack of safe and effective targeting delivery systems in vivo, especially in the central nervous system (CNS).

Methods: Lipid-polymer hybrid nanoparticles (LPHNs-cRGD) were constructed for efficient and targeting delivery of CRISPR/Cas9 plasmids targeting O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT), a drug-resistance gene to temozolomide (TMZ). Focused ultrasound (FUS)-microbubbles (MBs) were used to non-invasively and locally open the BBB to further facilitate gene delivery into glioblastoma in vivo. The gene editing efficiency and drug sensitivity changes were evaluated both in vitro and in vivo.

Results: The gene-loaded LPHNs-cRGD were successfully synthesized and could protect

pCas9/MGMT from enzyme degradation. LPHNs-cRGD could target GBM cells and mediate the transfection of pCas9/MGMT to downregulate the expression of MGMT, resulting in an increased sensitivity of GBM cells to TMZ. MBs-LPHNs-cRGD complexes could safely and locally increase the permeability of the BBB with FUS irradiation in vivo and facilitated the accumulation of nanoparticles at the tumor region in orthotopic tumor-bearing mice. Furthermore, the FUS-assisted MBs-LPHNspCas9/MGMT-cRGD enhanced the therapeutic effects of TMZ in glioblastoma, inhibited tumor growth, and prolonged survival of tumorbearing mice, with a high level of biosafety.

Conclusion: In this work, we constructed LPHNs-cRGD for targeting delivery of the CRISPR/Cas9 system, in combination with FUS-MBs to open the BBB. The MBs-LPHNscRGD delivery system could be a potential alternative for efficient targeting gene delivery for the treatment of glioblastoma.

Keywords: CRISPR/Cas9, LPHNs, FUS, microbubbles, glioblastoma