PII: S0956-5663(20)30070-1

DOI: https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112073

Reference: BIOS 112073

To appear in: Biosensors and Bioelectronics

Received Date: 27 December 2019

Revised Date: 30 January 2020

Accepted Date: 3 February 202

作者：

Shanying Han, Yueshuang Xu, Jie Sun, Yufeng Liu, Yuanjin Zhao, Weiguo Tao,

Renjie Chai

引用瑞禧生物产品：

Fluorescein isothiocyanate (FITC) labelled nanoprobes (DSPE- PEG-FITC) and Biotin-PEG-DSPE

Abstract 

With the function of mediating intercellular communication between cells, extracellular vesicles (EVs) have been intently studied for their physiopathology and clinical application values. However, efficient EV isolation from biological fluids remains a significant challenge. To address this, this work constructs a new microvortex chip that can isolate EVs efficiently by integrating the lipid nanoprobe modified Morpho Menelaus (M. Menelaus) butterfly wing into microfluidic chip. M. Menelaus wing is well known for its orderly arranged periodic nanostructures and can generate microvortex when liquid passes through it, leading to increased interaction between EVs and M. Menelaus wing. In addition, the nanoprobe containing lipid tails can be inserted into EVs through their lipid bilayer membrane structure. Based on the described properties, high-throughput enrichment of EVs with over 70% isolation efficiency was realized. Moreover, it was demonstrated that the nanoprobe system based on M. Menelaus wing enabled downstream biological analysis of nucleic acids and proteins in EVs. Microvortex chips showed potential application value in efficient EV isolation for biomedical research and cancer diagnosis.

Keywords: extracellular vesicle; isolation; butterfly; microfluidics; biochip

摘要

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是一类由细胞主动分泌的纳米级膜性囊泡，通过转运蛋白质、脂质、核酸等生物活性物质介导细胞间通讯，在生理过程调控与病理发展进程中发挥重要作用，相关技术路径在生物医学研究领域展现出可观的应用前景。然而当前从复杂生物体液体系中完成细胞外囊泡的高效分离，仍存在诸多待突破的技术瓶颈：传统超速离心法操作流程繁琐、处理周期长，样本回收率偏低且易引入杂质；商用聚乙二醇沉淀法易伴随大量非囊泡类蛋白共沉淀，影响后续下游分析的准确性；免疫亲和捕获法受限于抗体成本与靶标覆盖范围，难以实现广谱性的囊泡富集。为应对上述技术局限，本研究构建了一种新型微涡流生物芯片，将经脂质纳米探针修饰的Morpho Menelaus闪蝶翅作为核心功能单元集成入微流控体系，利用蝶翅表面天然形成的周期性有序微纳结构，在液体流经时生成稳定微涡流，大幅提升流体中细胞外囊泡与功能基底的碰撞接触概率。同时，修饰于蝶翅表面的脂质纳米探针可通过自身疏水脂质尾部，嵌入细胞外囊泡的脂质双分子层结构，实现对囊泡的稳定锚定。依托上述双重机制，本研究完成了细胞外囊泡的高通量富集，分离效率可达70%以上。后续验证实验进一步证实，该芯片捕获的细胞外囊泡可支持核酸提取、蛋白标志物检测等下游生物学分析操作，为低样本量条件下的囊泡分离与表征提供了新的技术路径，在生物医学基础研究领域具备潜在应用价值。

关键词

细胞外囊泡；闪蝶翅；微涡流；微流控芯片；脂质纳米探针

1 引言

细胞外囊泡作为细胞分泌的纳米级膜性结构，广存在于血浆、尿液、唾液等各类生物体液中，其内部包裹的核酸、蛋白质等生物分子可直接反映来源细胞的生理与病理状态，是液体活检技术体系中重要的生物信息载体。近年来，随着囊泡相关研究的不断深入，学界对高纯度、高回收率的细胞外囊泡分离技术需求持续提升，传统分离方法的固有缺陷也逐渐显现：超速离心法作为早期的主流分离手段，不仅需要昂贵的大型设备，长时间高速离心还容易造成囊泡结构破损，导致内部生物分子降解；尺寸排阻法虽然能较好保留囊泡完整性，但样本处理通量低，大体积样本分离耗时极长，难以适配批量样本的处理需求。

微流控芯片技术的发展为细胞外囊泡分离提供了微型化、集成化的新方案，现有微流控分离体系多通过人工刻蚀的微结构实现流体调控，但其制备流程复杂、加工成本较高，部分精细纳米结构的批量复制仍存在精度控制难题。自然界中的生物功能结构为解决这一问题提供了天然灵感，Morpho Menelaus闪蝶翅表面演化出了高度有序的三维周期性微纳结构，该结构在流体通过时可自发形成局部微涡流，无需额外复杂的微结构设计即可强化流体混合效果，为提升囊泡与基底的相互作用效率提供了天然的功能界面。

本研究以闪蝶翅天然微纳结构为核心，通过表面功能化修饰引入脂质纳米探针，构建集成化微涡流生物芯片，在简化制备流程的同时提升细胞外囊泡的分离效率，为后续囊泡内生物分子的分析提供稳定的技术支撑。

2 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

本研究使用的Morpho Menelaus闪蝶翅标本采购自合规昆虫标本供应商；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）等化学试剂均采购自通用化学试剂平台；脂质纳米探针核心组分DSPE-PEG-Biotin采购自生物试剂供应商；实验用水为经 Milli-Q 系统纯化的超纯水，所有试剂均为分析纯级别，未经过进一步纯化处理。

2.2 闪蝶翅基底的功能化修饰

闪蝶翅基底的修饰操作全程在室温条件下进行，具体步骤如下：

1. 将预处理完成的洁净闪蝶翅片浸入体积分数为5%的APTES乙醇溶液中，低速搅拌2小时，使翅片表面引入活性氨基基团；

2. 取出翅片用无水乙醇反复冲洗3次，去除表面未结合的APTES分子，随后将其浸入含琥珀酸酐（SA）与4-二甲氨基吡啶（DMAP）的二甲基亚砜（DMSO）溶液中，孵育4小时完成表面羧基化修饰；

3. 取出翅片用DMSO与乙醇依次冲洗，随后将其浸入由EDC与NHS配制的活化液中，避光孵育30分钟，激活表面羧基位点；

4. 将活化后的翅片转移至亲和素（Avidin）溶液中，室温孵育2小时，通过亲和素与生物素的特异性结合，将预先制备的DSPE-PEG-Biotin脂质纳米探针固定于翅片表面，完成功能化基底的制备。

2.3 微涡流生物芯片的组装

将修饰完成的闪蝶翅功能单元嵌入预先设计的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道中，通道内部预留的流体腔室尺寸与蝶翅片尺寸完全匹配，通过氧等离子体处理完成PDMS层与玻璃基底的键合，终形成具备进样口、微涡流反应腔与出样口的完整微流控芯片体系。实验过程中通过微量注射泵控制流体进样流速，保证生物体液样本以稳定的流速流经闪蝶翅功能区域。

2.4 细胞外囊泡分离与性能表征

本研究采用细胞培养上清液作为囊泡分离的测试样本，预先通过纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）测定样本中初始细胞外囊泡的浓度，将样本以设定流速通入微涡流芯片后，收集流出液再次测定其中剩余的囊泡浓度，通过浓度差值计算芯片的囊泡分离效率。同时，采用扫描电子显微镜（SEM）对捕获于蝶翅表面的细胞外囊泡进行形貌表征，观察囊泡的完整附着状态。

为验证芯片捕获囊泡的下游分析兼容性，实验过程中采用专用裂解液对捕获的囊泡进行裂解，分别提取内部的总RNA与总蛋白，通过核酸定量试剂测定RNA得率，采用蛋白质免疫印迹法检测囊泡表面标志性蛋白CD9的表达情况，验证下游生物分析的可行性。

3 结果与讨论

3.1 闪蝶翅微结构的流体调控效果

通过光学显微镜与扫描电子显微镜观察可见，Morpho Menelaus闪蝶翅表面分布着大量平行排列的微沟槽结构，脊线之间的间距处于0.5~5μm区间，脊线表面进一步分布着周期约200nm的多层分支纳米结构，这种天然形成的多级微纳结构在流体流经时，可在局部区域形成稳定的微涡流，打破层流状态下流体仅沿通道方向运动的局限，大幅提升流体中悬浮颗粒与基底的碰撞概率。相较于人工光刻制备的平面微结构，天然蝶翅的三维多级结构无需复杂的多步刻蚀工艺即可实现更优的流体扰动效果，显著降低了微流控芯片的制备门槛。

3.2 细胞外囊泡的分离效率验证

纳米颗粒跟踪分析的测试结果显示，在优化的进样流速条件下，该微涡流生物芯片对细胞外囊泡的分离效率可达到70%以上，显著高于同等通道尺寸下未集成蝶翅功能单元的空白微流控芯片。分析其作用机制可知，微涡流带来的强化混合效果，大幅提升了囊泡与功能基底的接触频率，而脂质纳米探针与囊泡脂质双分子层的亲和作用，可将接触到基底的囊泡稳定锚定，二者协同作用共同实现了囊泡的高效富集。同时，该体系对粒径分布在30~200nm区间内的囊泡群体均可实现有效捕获，具备较广的靶标覆盖范围。

3.3 下游生物分子分析的可行性

对芯片捕获的细胞外囊泡进行后续处理后，核酸定量结果显示可从捕获的囊泡中提取得到完整的总RNA，且样本中18S与28S核糖体RNA的占比极低，表明几乎无细胞来源的RNA污染，可支持后续的小RNA测序等转录组分析操作。蛋白质免疫印迹实验可清晰检测到囊泡标志性蛋白CD9的特异性条带，证明捕获过程未对囊泡内部蛋白的抗原活性造成明显破坏，可满足后续蛋白标志物的定性与定量分析需求。这一特性使得该芯片可适配低样本量的应用场景，对仅能获取少量细胞的组织样本，也可完成细胞外囊泡的提取与后续分析操作。

4 结论

本研究依托Morpho Menelaus闪蝶翅的天然多级微纳结构，构建了集成化的微涡流生物芯片，通过微涡流强化流体相互作用与脂质纳米探针亲和捕获的双重机制，实现了细胞外囊泡的高效富集，分离效率可达70%以上。该芯片无需复杂的人工微纳加工步骤，制备流程简便，捕获的囊泡可直接支持后续核酸与蛋白质层面的下游生物分析，为细胞外囊泡分离提供了一种新的技术方案，在生物医学基础研究领域具备潜在的应用空间。