脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles，LNPs）是核酸药物递送研究中广使用的纳米载体之一。通过合理组合可离子化脂质、辅助磷脂、胆固醇及PEG化脂质，LNP能够对mRNA、siRNA等核酸分子进行包封，并在一定程度上改善其稳定性与细胞递送表现。

然而，常规LNP的细胞摄取通常受到颗粒尺寸、表面性质、蛋白冠形成及细胞类型等因素的共同影响，难以仅凭脂质配方实现特定细胞的高效识别。

为进一步提高LNP对目标细胞的识别能力，研究人员尝试在颗粒表面引入叶酸（Folic Acid，FA）等靶向配体。叶酸可与部分细胞表面表达的叶酸受体（Folate Receptor，FR）结合，为构建受体介导的纳米递送体系提供了研究思路。

其中，叶酸修饰脂质的添加比例，是影响LNP表面配体展示、受体结合、细胞摄取及后续递送效果的重要配方参数。

值得注意的是，叶酸修饰比例并非越高越好。配体密度过低可能难以产生明显的靶向作用，而过高的配体密度则可能改变颗粒表面结构、增加空间位阻，甚至影响LNP稳定性与有效递送。因此，寻找适宜的叶酸修饰比例，是开发叶酸靶向LNP体系的重要研究内容。

一、叶酸修饰LNP的结构基础与靶向机制

LNP通常由多种脂质组分构成，不同组分承担不同的结构与功能任务。对于叶酸靶向LNP，常见设计是在PEG化脂质的末端连接叶酸分子，形成FA-PEG-Lipid，再将其引入LNP体系。

这种设计既可利用PEG连接臂改善叶酸在颗粒表面的空间展示，也能够通过脂质疏水链将功能分子锚定在LNP结构中。

叶酸靶向LNP的典型组成

叶酸受体α（FRα）在部分肿瘤细胞中存在较高表达，因此叶酸修饰纳米载体常被用于肿瘤靶向递送研究。不过，FRα并非所有肿瘤细胞都高表达，正常组织中也可能存在叶酸受体表达。

此外，叶酸受体结合并不等同于核酸成功进入胞质。对于mRNA或siRNA递送体系，内体逃逸及载荷释放仍是决定终生物学效果的重要步骤。

二、叶酸修饰脂质比例为何会影响细胞摄取？

在LNP表面功能化过程中，叶酸修饰脂质的比例通常以其占总脂质的摩尔百分比（mol%）表示，也有研究将其定义为占PEG化脂质组分的百分比。

这两种定义并不相同，比较不同研究结果时应首先确认计算口径。

随着FA-PEG-Lipid投料比例变化，LNP表面可能出现以下变化：

•    配体密度变化： 叶酸分子在颗粒表面的平均数量与间距发生改变。

•    空间位阻变化： PEG链及末端叶酸可能影响配体与受体的接近程度。

•    颗粒物理性质变化： 粒径、分散性、表面电位及脂质排列可能发生变化。

•    细胞相互作用变化： 受体结合、非特异性吸附和内吞路径的相对贡献可能改变。

因此，细胞摄取效率通常是多个因素共同作用的结果，而非仅由叶酸分子数量决定。

三、叶酸修饰比例与细胞摄取效率的关系

在一定条件下，叶酸修饰脂质比例与细胞摄取之间可能呈现先升高、后趋于平台甚至下降的非线性关系。这一趋势可从低配体密度、中等配体密度及高配体密度三个阶段进行理解。

不同叶酸修饰比例下的细胞摄取趋势

不同修饰密度的作用机制

从材料设计角度来看，叶酸靶向LNP的关键并非追求高配体数量，而是使表面叶酸具有足够的可接近性，并维持LNP原有的核酸包封、结构稳定和胞内递送能力。

四、影响叶酸修饰效果的其他关键因素

叶酸修饰比例是重要参数，但不能脱离LNP整体配方独立分析。特别是PEG连接臂长度、细胞叶酸受体表达以及实验培养条件，均可能改变观察到的摄取结果。

关键因素与实验影响对照

五、如何设计不同叶酸修饰比例的LNP对照实验？

为了更准确地判断叶酸比例对细胞摄取的影响，可采用梯度配方与多维度检测相结合的研究方案。

示例实验分组设计

以上为探索性分组示例，非经过验证的推荐配方。实际比例范围应依据总PEG脂质比例、脂质锚定方式及目标细胞调整。

在对照实验中，建议尽可能保持总脂质浓度、核酸投料、总PEG化脂质比例及核心脂质组成一致。例如，当FA-PEG-Lipid比例增加时，可考虑相应减少不带叶酸的同类PEG-Lipid，以降低总PEG含量变化造成的混杂影响。

不过，这种替换也可能改变脂质锚定链或分子构象，因此需要选择结构尽可能匹配的对照材料。

推荐检测流程

在这一过程中，建议特别区分“颗粒被细胞摄取”与“核酸成功发挥功能”两个概念。

荧光标记LNP被细胞内吞后，荧光信号可能滞留于内体或溶酶体中，并不代表核酸已释放至胞质。因此，对于mRNA递送体系，应进一步检测报告蛋白表达；对于siRNA体系，则应结合靶基因mRNA或蛋白水平的变化进行验证。

六、细胞摄取量与实际核酸递送效率是否一致？

两者并不总是一致。

LNP细胞摄取属于载体进入细胞的过程，而核酸递送还涉及内体逃逸、核酸释放及生物学功能发挥等多个步骤。

摄取与功能递送的差异示意

以下为假设性归一化数据，用于展示两类指标可能不完全同步，并非实际实验测量。

 

在示例中，中比例叶酸修饰组的细胞摄取高，但其功能表达并未达到同样的归一化数值。这类差异可能来自内体逃逸、细胞内转运、核酸释放或蛋白表达过程中的限制。

因此，判断叶酸修饰比例是否合适，应采用综合评价方式，而不是仅比较流式细胞术得到的平均荧光强度。

可考虑同时分析以下三个层面：

•    材料层面： 粒径、PDI、包封率、储存稳定性及表面叶酸展示。

•    细胞层面： 受体依赖性摄取、细胞内定位及细胞活力。

•    功能层面： mRNA表达、siRNA沉默或其他目标核酸的功能性终点。

  

七、叶酸修饰LNP的应用研究方向

八、叶酸修饰LNP研究中需要关注的技术问题

尽管叶酸具有分子量相对较小、化学修饰方式较多等特点，但在实际LNP体系中，仍存在若干值得关注的问题。

其一，投料比例不等于实际表面展示密度。 部分FA-PEG-Lipid可能未有效进入颗粒，或在后续处理过程中发生交换与脱附。因此，需要在条件允许时测定实际结合量或表面可及性。

其二，细胞模型可能显著影响结果。 同一种LNP在不同细胞中的摄取效率可能存在差异。建议结合叶酸受体表达检测及受体竞争实验，判断叶酸修饰是否真正带来受体依赖性增强。

其三，体外摄取优势不一定能转化为体内靶向优势。 在体内环境中，蛋白冠、血液循环、组织分布和单核吞噬细胞系统等因素均可能影响LNP的行为。

其四，配体密度与PEG屏蔽之间需要平衡。 PEG化脂质有利于改善某些体系的胶体稳定性，但也可能抑制细胞膜相互作用。叶酸配体的展示必须与LNP整体界面设计相协调。

九、总结与展望

叶酸修饰脂质比例是调控LNP细胞识别与摄取行为的重要参数。通过改变FA-PEG-Lipid在脂质配方中的占比，可以调节表面叶酸的展示情况，并可能影响受体结合、细胞内吞及核酸递送效率。

但叶酸修饰比例与细胞摄取效率之间并不存在适用于所有LNP体系的固定线性关系。不同核心脂质组成、PEG连接臂、细胞模型和培养条件，都可能改变良好修饰范围。

因此，在开展叶酸靶向LNP研究时，应坚持以配方梯度设计为基础，以理化表征和受体依赖性实验为支撑，并将功能性核酸递送结果纳入终评价。

从未来发展方向来看，叶酸修饰LNP有望进一步与多配体协同修饰、可脱落PEG结构及响应性脂质设计相结合，为构建更加精细化的核酸递送系统提供研究空间。

对于瑞禧生物相关技术内容，可围绕FA-PEG-Lipid功能脂质、叶酸靶向LNP构建、不同配体比例筛选、颗粒理化表征及细胞摄取评价等主题展开介绍。具体产品规格、定制服务与实验检测能力，应以瑞禧生物实际公布的信息为准。

参考文献与延伸阅读

以下文献可用于理解LNP递送、表面PEG化及叶酸受体靶向的理论基础：

• Hou X., Zaks T., Langer R., Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials, 2021, 6: 1078–1094. DOI: 10.1038/s41578-021-00358-0.

• Mitchell M. J., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery, 2021, 20: 101–124. DOI: 10.1038/s41573-020-0090-8.

• Low P. S., Henne W. A., Doorneweerd D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research, 2008, 41(1): 120–129. DOI: 10.1021/ar7000815.