一、DSPE-PEG-MAL在LNP表面功能化中的作用

脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles，LNP）是一类由脂质组分构建的纳米递送体系，在核酸递送、药物载体及生物医学材料研究中具有重要应用价值。典型核酸LNP通常由可离子化脂质、辅助磷脂、胆固醇及PEG脂质等组分构成。

随着LNP研究从基础包封递送向组织识别和细胞靶向方向发展，如何在颗粒表面引入具有生物识别能力的功能分子，成为脂质纳米材料表面工程的重要课题。

多肽分子具有序列可设计、功能基团易引入及分子识别特性可调等优势，因此被广用于纳米载体表面功能化研究。

其中，DSPE-PEG-MAL是一种兼具脂质锚定结构、亲水性PEG连接臂和马来酰亚胺反应基团的功能化脂质衍生物，可用于构建具有巯基多肽连接能力的纳米颗粒表面界面。

其主要结构包括：

•    DSPE脂质端： 提供疏水锚定结构，可与适当的脂质膜或脂质纳米颗粒表面结合。

•    PEG连接臂： 增加亲水性，并调节反应基团与颗粒表面之间的空间距离。

•    MAL马来酰亚胺端： 与多肽上的游离巯基发生加成反应，形成共价连接结构。

这一组合为LNP表面引入靶向肽、细胞识别肽及其他含巯基功能分子提供了可研究的化学路径。

二、DSPE-PEG-MAL的结构组成与连接机制

DSPE-PEG-MAL与巯基多肽的偶联主要基于马来酰亚胺与巯基之间的Michael型加成反应。

当多肽分子中存在可反应的游离巯基时，巯基可与马来酰亚胺双键发生加成，形成硫代琥珀酰亚胺连接结构。

可用以下简化反应表示：

这里的产物表示形成了含硫共价连接结构，并非意味着连接键在所有生理条件下均具有完全相同的稳定性。

马来酰亚胺-巯基加成产物在某些环境中可能发生逆Michael反应或巯基交换，具体稳定性与连接结构、介质条件和后续环开裂状态有关。

三、LNP表面巯基多肽偶联的主要技术路径

DSPE-PEG-MAL用于LNP功能化时，通常需要考虑功能脂质进入LNP表面的方式，以及多肽偶联发生的阶段。

第一种路线的特点是可在已经形成的LNP表面进行多肽偶联，有利于将颗粒制备与后续配体连接分开研究。

第二种路线则先获得多肽功能化脂质，再通过适当的脂质组装或后插入策略将其引入LNP体系。

需要注意，DSPE脂质端能够锚定于某些脂质结构，并不代表其在所有LNP配方中都能以相同效率插入或长期保留。 LNP脂质组成、表面结构、PEG脂质交换行为及制备条件均可能影响终修饰效果。

四、影响DSPE-PEG-MAL与巯基多肽偶联的关键因素

在LNP表面多肽功能化过程中，偶联效率不仅取决于MAL与巯基之间的反应活性，还受到反应环境、分子结构、表面密度和纳米颗粒稳定性等多种因素影响。

关键因素对照表

1. 反应pH：兼顾巯基反应活性与MAL稳定性

马来酰亚胺与巯基之间的加成反应具有明显的pH依赖性。

在适当的近中性条件下，巯基多肽能够与马来酰亚胺发生较为有效的偶联。当pH过低时，巯基的反应活性可能降低；当pH偏高时，虽然巯基反应性可能增强，但马来酰亚胺环水解及其他竞争反应的风险也可能增加。

对于一般的MAL-巯基偶联研究，常以pH约6.5–7.5作为初步考察区间，但这不是适用于所有LNP和多肽体系的固定良好条件。

另外，缓冲液中的成分同样需要考虑。含游离巯基的还原剂可能竞争消耗MAL基团，某些含伯胺缓冲组分在特定条件下也可能带来副反应或分析干扰。

因此，应结合多肽性质和LNP耐受性选择反应介质。

2. PEG分子量：决定多肽的空间暴露程度

PEG链是连接DSPE脂质锚定端与MAL反应端的重要结构。

较短的PEG链可能使偶联多肽距离LNP表面较近，部分多肽识别位点可能受到颗粒表面或相邻脂质分子的空间遮挡。

较长的PEG链则可能使多肽向水相伸展，提高其与外部靶标接触的机会。

但过长的PEG链也可能改变LNP的表面水化层厚度、配体运动自由度以及细胞膜相互作用。

常见研究中可比较不同分子量的DSPE-PEG-MAL，例如PEG1000、PEG2000及PEG5000等规格，但具体可用规格应以供应商实际产品资料为准。

3. MAL表面密度：并非越高越有利

MAL基团在LNP表面的密度决定了理论上可供巯基多肽偶联的反应位点数量。

当MAL表面密度较低时，可偶联多肽数量可能受到限制；当MAL密度增加时，理论偶联容量提高，但相邻多肽之间的空间拥挤也可能增强。

如果多肽具有较大分子尺寸、较强电荷或疏水性，高密度修饰还可能改变LNP的表面电性、胶体稳定性和生物学行为。

因此，需要区分三个不同指标：

• MAL脂质在配方中的投料比例。

• LNP表面实际可接近的MAL位点数量。

• 偶联完成后实际连接的多肽数量。

这三项指标通常并不完全相等。

4. 巯基多肽的结构与反应活性

巯基多肽通常通过引入半胱氨酸（Cys）获得可反应的—SH基团。

多肽中半胱氨酸的位置会影响偶联后的配体取向。如果将Cys设计在多肽末端，并通过适当的间隔结构与识别序列分开，通常更便于研究连接方向对生物识别能力的影响。

但需要特别关注以下情况：

巯基氧化： 游离巯基可能被氧化形成二硫键，导致实际可参与偶联的巯基数量减少。

多位点偶联： 如果多肽含有多个可反应巯基，可能形成不同连接产物，甚至造成颗粒之间的桥连。

多肽构象变化： 偶联位点靠近关键识别区域时，可能影响多肽原有的构象或靶标结合能力。

因此，在设计LNP表面巯基多肽时，需要同时考虑化学偶联效率与偶联后的功能保留情况。

五、偶联反应与LNP胶体稳定性的关系

LNP是由多种脂质组分形成的复杂纳米体系，其结构对配方组成、介质条件和表面修饰过程较为敏感。

引入DSPE-PEG-MAL及巯基多肽后，颗粒表面可能发生以下变化：

对于核酸负载LNP，除了验证多肽偶联成功，还应比较偶联前后核酸包封率、颗粒完整性以及实际递送功能是否发生变化。

六、如何评价DSPE-PEG-MAL与巯基多肽的偶联效果？

建议将分析工作分为三个层次：化学连接确认、纳米颗粒表征和生物功能验证。

偶联效率与多肽修饰量的区别

如果能够可靠测定未反应的游离多肽，则可计算表观多肽消耗率：

其中，\(n_0\) 为初始加入的多肽物质的量，\(n_{\mathrm{free}}\) 为反应后检测到的游离多肽物质的量。

需要注意，多肽消耗率不能直接等同于LNP表面共价偶联效率，因为多肽可能发生非特异性吸附、氧化或其他副反应。

更严格的偶联效率应基于经过纯化、验证为共价连接的多肽量进行计算。

七、不同偶联条件的实验结果展示示例

为了直观说明如何分析不同MAL表面密度对LNP多肽修饰的影响，下面提供一组模拟数据。

以下所有数据均为假设性演示，不代表瑞禧生物产品实测性能。

从这组假设结果可以看出，增加MAL密度可能提高多肽偶联量，但高密度修饰同时可能伴随PDI增大。

这说明材料优化不能仅以高偶联效率作为判断标准，还应考虑颗粒均匀性、稳定性和终生物功能。

八、DSPE-PEG-MAL功能化LNP的应用研究方向

九、DSPE-PEG-MAL表面偶联的技术难点与优化方向

避免MAL活性基团过早失活

MAL基团在不适当的水相条件下可能发生水解，降低后续巯基偶联能力。因此，功能脂质的保存、溶解和水相暴露过程需要与具体产品的稳定性要求相匹配。

控制游离巯基的有效含量

多肽中的游离巯基容易受到氧化状态影响。对于含有半胱氨酸的多肽，应区分总多肽浓度与实际可反应巯基浓度，避免因二硫键形成而高估偶联反应的理论效率。

兼顾PEG表面屏蔽与配体识别

PEG链有助于调节LNP表面界面性质，但过密的PEG层可能影响多肽与细胞受体接近。多肽密度和PEG覆盖程度之间存在需要实验确定的平衡关系。

关注偶联产物在复杂介质中的稳定性

传统马来酰亚胺-巯基加成产物在某些生物环境中可能发生交换反应。对长期稳定性要求较高的研究，可进一步考察连接结构的稳定化处理及其对多肽活性的影响。

十、从材料设计到功能验证的整体研究流程

十一、研究发展趋势：从多肽接枝走向可控表面工程

DSPE-PEG-MAL在LNP表面功能化中的价值，不仅体现在能够通过MAL与巯基反应实现多肽连接，更在于提供了一种可调节的脂质-聚合物-配体界面设计方式。

未来研究可重点关注以下方向：

• 配体密度精准调控： 从功能脂质投料比例控制进一步发展到实际表面多肽密度定量。

• 连接结构稳定性研究： 评价硫代琥珀酰亚胺连接结构在不同生物介质中的稳定性。

• 多肽取向与空间可及性： 研究PEG链长、连接位点与靶标结合能力之间的关系。

• LNP组成与表面功能协同： 综合优化脂质锚定、颗粒结构及核酸递送功能。

• 多功能配体设计： 探索不同功能配体的组合修饰及其对细胞识别行为的影响。

十二、总结

DSPE-PEG-MAL是一类适用于脂质纳米颗粒表面功能化研究的反应性PEG脂质材料。其DSPE端提供脂质锚定能力，PEG链提供亲水性与空间连接结构，MAL端则能够与含游离巯基的多肽发生共价加成反应。

在实际LNP表面多肽偶联过程中，反应pH、PEG分子量、MAL表面密度、多肽巯基状态、脂质组成及纯化方式均可能影响终功能化效果。

其中，偶联效率、颗粒稳定性和生物识别能力需要作为相互关联但又独立的评价指标。 较高的多肽连接量并不必然意味着更好的靶向递送性能。

对于瑞禧生物DSPE-PEG-MAL相关技术内容，可重点围绕分子结构、巯基偶联化学、LNP表面功能化策略、关键反应因素及应用研究展开，突出功能化PEG脂质在纳米递送体系中的研究价值。