UiO-66作为典型的锆基金属有机框架材料（Metal–Organic Frameworks，MOFs），凭借其规则的多孔结构、较高的比表面积、可调控的表面化学性质以及相对良好的结构稳定性，在生物传感、蛋白固定化、酶催化和功能纳米材料等领域受到广关注。
随着生物功能材料研究不断深入，单纯依靠UiO-66自身的孔道结构与物理吸附能力，已难以满足蛋白质定向固定、界面稳定连接和复杂生物环境应用的需求。通过对UiO-66进行表面羧基功能化，在材料外表面引入可参与化学反应的—COOH基团，可为后续蛋白质偶联提供反应位点，进一步拓展其在生物医学及生物分析领域的应用空间。
本文围绕UiO-66表面羧基功能化的设计思路、修饰方法、蛋白偶联机制、表征技术及应用方向展开介绍，并结合实验设计要点，探讨该类功能化MOF材料的研究价值。
一、UiO-66的结构特点与表面功能化价值
UiO-66是一类以Zr₆氧簇为无机节点、以对苯二甲酸配体为有机连接单元构筑的三维多孔框架材料。其典型结构由十二连接的锆氧簇与有机配体形成，具有较为稳定的空间骨架。
与部分结构稳定性较弱的MOF材料相比，UiO-66在适宜条件下表现出较好的化学稳定性，为其后续表面修饰及生物分子负载提供了材料基础。不过，其实际稳定性仍受颗粒尺寸、缺陷程度、溶液pH、磷酸盐浓度及处理时间等因素影响。
UiO-66的主要材料特征
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结构特征 |
材料优势 |
生物应用意义 |
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Zr₆氧簇节点 |
构建相对稳定的骨架 |
支持进一步表面化学修饰 |
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三维微孔结构 |
具有可利用的孔隙空间 |
有利于小分子传质及负载 |
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有机配体可设计 |
可引入多种官能团 |
实现功能化界面构建 |
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表面缺陷与端基 |
提供潜在修饰位点 |
便于接枝连接分子 |
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可调颗粒形貌 |
调节分散与界面性质 |
适配不同生物实验体系 |
需要注意的是，典型UiO-66的微孔孔径通常不足以容纳多数完整球状蛋白。因此，对于常见蛋白质，偶联主要发生在颗粒外表面，而不是蛋白质整体进入框架内部孔道。
二、为什么要对UiO-66进行表面羧基功能化？
未经专门修饰的UiO-66虽然可能通过静电作用、氢键、配位作用或其他非共价相互作用吸附蛋白质，但这类固定化方式在部分实验条件下容易受到溶液离子强度、pH变化及竞争性吸附分子的影响。
引入羧基后，可将材料表面的吸附界面进一步转变为具有化学偶联能力的反应界面。
表面羧基化与蛋白偶联的基本路径
UiO-66纳米颗粒
稳定的锆基金属有机框架↓ 表面修饰 / 功能配体引入
UiO-66—COOH
形成可进一步活化的羧基界面↓ EDC/NHS活化与蛋白氨基反应
UiO-66—CONH—Protein
形成共价连接的蛋白功能化材料羧基化的价值主要体现在三个方面。
首先，羧基能够作为后续酰胺化反应的活性前体，使材料表面与蛋白质氨基之间形成较为稳定的共价连接。其次，通过控制羧基密度和连接臂结构，可在一定程度上调节蛋白质固定量与界面空间环境。后，羧基还可用于连接聚乙二醇（PEG）、荧光标记分子、多肽及其他功能基团，为构建多功能复合材料提供化学基础。
但需要强调，羧基数量增加并不必然意味着蛋白活性提高。过高的表面修饰密度可能带来空间位阻、颗粒聚集或蛋白构象变化，因此应兼顾偶联效率与蛋白生物活性。
三、UiO-66表面羧基功能化的主要方法
针对不同的实验目标，UiO-66羧基化可采用配体设计、合成后修饰及表面接枝等策略。不同路线在功能基团分布、材料结构保持程度以及后续偶联便利性方面存在差异。
不同功能化策略的对比
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方法 |
主要特点 |
需要重点关注的问题 |
|---|---|---|
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功能配体引入 |
可调节框架化学组成 |
配体配位方式、结构完整性 |
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合成后共价修饰 |
修饰路径较清晰 |
接枝效率、反应选择性 |
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表面配位接枝 |
适合构筑外层功能界面 |
配位稳定性、功能层脱附 |
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聚合物功能层修饰 |
有利于调节分散性及间距 |
包覆厚度、传质阻力 |
对于以蛋白偶联为主要目的的研究，通常需要优先考虑外表面羧基的可及性，而不仅仅是材料整体的羧基含量。
四、UiO-66—COOH与蛋白质的偶联机制
蛋白质表面通常存在赖氨酸残基的ε-氨基以及部分可利用的N端氨基。这些基团可参与羧基活化后的酰胺化反应。
EDC/NHS偶联是常用的羧基—氨基连接策略之一。
反应可分为两个关键阶段。
第一阶段为羧基活化。 EDC与羧基反应形成活性中间体，NHS或Sulfo-NHS可进一步形成相对更易操作的活性酯，从而为后续氨基进攻创造条件。
第二阶段为蛋白质偶联。 活化后的材料与蛋白质接触，蛋白表面的可反应氨基进攻活性酯，终形成酰胺键，实现蛋白与MOF载体的共价连接。
该方法具有反应条件相对温和、适用蛋白种类较多等特点，但属于非位点特异性偶联。不同赖氨酸残基参与反应可能产生多种连接取向，因此不能直接将共价固定等同于定向固定。
此外，活性酯在水溶液中会发生水解，过度活化还可能导致蛋白质交联或颗粒间桥连。对于活性敏感的蛋白，应通过实验优化反应时间、投料比例及缓冲体系。
五、蛋白偶联实验的设计与优化
在实际研究中，UiO-66—COOH的蛋白偶联效果不仅取决于羧基活化效率，还与材料分散性、蛋白性质及溶液环境密切相关。
实验流程建议
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↓ 材料预处理
将UiO-66—COOH充分分散于经过筛选的缓冲体系中，检测颗粒分散性、pH适应性和框架稳定性。
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↓ 表面羧基活化
使用EDC/NHS体系进行活化，并根据活性酯稳定性合理控制反应时间。活化阶段通常可从弱酸性条件进行筛选。
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↓ 蛋白偶联
加入目标蛋白，在兼顾氨基反应效率与蛋白稳定性的条件下进行反应。偶联阶段可从接近中性的条件开始优化。
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↓ 分离与纯化
通过适宜的离心、过滤或其他分离方式去除未结合蛋白及小分子试剂，并避免因过强离心造成不可逆聚集。
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↓ 偶联效果验证
综合分析蛋白负载量、表面性质、框架结构、洗涤稳定性及蛋白功能保留情况。
关键实验因素
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影响因素 |
优化方向 |
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缓冲液 |
避免强配位组分干扰锆基框架，评估缓冲液与偶联反应的相容性 |
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pH |
兼顾羧基活化、蛋白氨基反应性及蛋白构象稳定性 |
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羧基密度 |
避免表面过度修饰导致空间拥挤 |
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蛋白投料量 |
通过梯度实验确定适宜的蛋白与载体比例 |
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反应时间 |
平衡偶联程度、活性酯水解及蛋白活性 |
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分散状态 |
控制颗粒聚集，保证表面位点充分暴露 |
尤其值得注意的是，磷酸盐缓冲液并不一定适合所有UiO-66偶联体系。已有研究表明，不同缓冲体系可能影响锆基MOF的结构、蛋白固定效果和酶催化活性。因此，使用PBS前应进行相容性验证。
六、如何表征UiO-66羧基化与蛋白偶联效果？
单一检测结果通常不足以证明蛋白已通过共价键固定在UiO-66表面。更可靠的研究方案应结合结构、表面化学和功能检测。
建议的多维度表征体系
PXRD FTIR / XPS
框架晶体结构 官能团与表面化学
SEM / TEM DLS / Zeta
颗粒形貌与尺寸 水合粒径与表面电性
BET BCA / Bradford
孔结构与比表面积 蛋白负载量
其中，FTIR和XPS可以为表面官能团变化提供证据，但UiO-66原有配体本身含有配位羧酸根，因此不能仅凭羰基相关吸收峰判断是否成功引入了可偶联的游离羧基。
蛋白固定量可通过上清液中蛋白浓度的变化进行初步估算：
其中，\(m_0\) 为初始蛋白质量，\(m_s\) 为反应后上清液中的蛋白质量，\(m_w\) 为各次洗涤液中蛋白质量总和。
这一计算反映的是表观固定化效率，不能单独区分共价偶联与物理吸附。应设置未活化UiO-66—COOH、未修饰UiO-66及其他必要对照，并结合充分洗涤后的蛋白保留情况进行分析。
七、UiO-66表面羧基化后的主要蛋白偶联应用
文献研究对比：不同表面官能团并非效果相同
2024年发表于 International Journal of Biological Macromolecules 的一项研究，对UiO-66、UiO-66-NH₂、UiO-66-COOH及羟基化衍生材料进行了比较，研究了细胞色素c和过氧化氢酶的固定化表现。
该研究发现，所测试体系中，单羟基功能化的UiO-66表现出更有利的酶负载和催化性能。这说明羧基化是一种具有应用价值的界面设计策略，但并非对所有蛋白都具有优性能。
功能化方案的选型思路
以下为定性设计参考，不代表实验性能排名。
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研究目标 |
优先考虑的设计方向 |
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稳定共价固定蛋白 |
可及性较好的—COOH或—NH₂反应位点 |
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提高蛋白吸附能力 |
表面电性、亲水性与蛋白亲和力 |
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保持酶催化活性 |
连接臂长度、固定取向与微环境 |
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构建多功能界面 |
羧基化与PEG、标记分子等组合 |
八、UiO-66—COOH蛋白偶联的技术挑战与发展方向
尽管羧基化UiO-66在生物偶联方面具有较大的研究潜力，但要获得结构明确、性能稳定的复合材料，仍需解决若干关键问题。
首先是表面官能团的定量与可及性。材料整体羧基含量并不能完全代表蛋白可接触的反应位点数量。未来可结合化学标记、滴定及表面分析等方法，提高功能化程度的表征准确性。
其次是蛋白质构象与功能保留。共价固定能够增强连接稳定性，却可能限制蛋白的局部运动或改变活性位点周围的环境。因此，可通过引入柔性连接臂、优化偶联位点和调节表面密度来改善蛋白活性。
再次是复杂介质中的材料稳定性。UiO-66在缓冲盐、蛋白混合物和生物体液中可能发生表面竞争配位、颗粒聚集或结构变化。对于长期使用体系，需要开展稳定性、浸出及功能保持实验。
从研究趋势来看，UiO-66表面修饰正在由单一官能团引入向多功能界面设计发展。2026年的相关综述也讨论了UiO-66在生物成像、光诊疗及靶向功能化等方向的应用潜力。
九、总结与展望
UiO-66表面羧基功能化为锆基金属有机框架材料与蛋白质之间建立化学连接提供了可行途径。通过合理设计表面修饰方法，并结合EDC/NHS等偶联体系，可以将材料的结构特征与蛋白质的识别、催化及生物功能相结合。
在实际研究中，应重点关注三个层面：一是保证MOF框架及颗粒分散状态的稳定；二是提高表面羧基的有效可及性和偶联反应的可控性；三是在实现蛋白固定的同时，尽可能保持其原有生物活性。
未来，随着表面化学调控、定向蛋白偶联和多功能纳米界面技术的发展，UiO-66及其衍生材料有望在生物传感、酶固定化和生物功能复合材料领域展现更丰富的应用价值。
瑞禧生物相关技术内容可围绕UiO-66羧基功能化、蛋白偶联、材料表征及定制化界面设计等方向展开。 具体材料规格、产品供应情况、定制能力和检测项目，应以瑞禧生物实际提供的信息为准。
参考文献
1. Yang F., et al. Insight into the efficient loading and enhanced activity of enzymes immobilized on functionalized UiO-66. International Journal of Biological Macromolecules, 2024. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.135557.
2. Ascioglu S., et al. Fabrication of lipase-immobilized proline-conjugated zirconium-based metal-organic framework (UiO-66-NH₂). Biochemical Engineering Journal, 2024. DOI: 10.1016/j.bej.2024.109242.
3. Buffer Effects in Zirconium-Based UiO Metal–Organic Frameworks (MOFs) That Influence Enzyme Immobilization and Catalytic Activity in Enzyme/MOF Biocatalysts.
4. Postsynthetic Modification of Zirconium Metal-Organic Frameworks. European Journal of Inorganic Chemistry, 2016.