随着mRNA疫苗、siRNA药物、基因编辑及核酸治疗技术的快速发展，脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles，LNP）已成为核酸药物递送领域的重要技术平台。LNP不仅能够保护核酸分子免受核酸酶降解，还能够促进核酸进入细胞，并通过调控胞内运输与内体逃逸过程，提高核酸药物的递送效率。

在LNP配方设计中，脂质组分的种类、比例及分子结构直接影响颗粒的形成过程、内部组织结构、粒径分布、表面性质和储存稳定性。其中，胆固醇（Cholesterol）作为LNP的重要辅助脂质之一，在调节脂质分子排列、颗粒结构完整性及膜相行为方面发挥着关键作用。

胆固醇含量的改变不仅可能影响LNP颗粒的形貌和内部结构，还可能进一步影响核酸包封效率、颗粒聚集倾向、储存稳定性及细胞内递送表现。因此，研究胆固醇含量与LNP理化性质之间的关系，对于建立稳定、高效且具有良好工艺重复性的核酸递送体系具有重要意义。

一、LNP的基本组成及胆固醇的结构调控作用

核酸递送LNP通常由四类脂质组分构成：可离子化脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰脂质（PEG-lipid）。

不同脂质组分在LNP形成与功能实现过程中承担不同作用。

与传统脂质体不同，核酸递送LNP通常并非简单的中空磷脂双层囊泡，而是具有复杂内部脂质组织结构的纳米颗粒。其内部结构受到脂质种类、配方比例、核酸载荷及制备工艺等多因素共同影响。

胆固醇具有刚性的甾环结构和较短的疏水侧链，同时含有一个极性羟基。这种两亲性分子结构使其能够插入脂质分子之间，与其他脂质发生疏水相互作用，从而改变脂质排列状态。

胆固醇的主要作用包括：

• 调节脂质分子堆积： 改变脂质分子之间的排列密度与局部有序程度。

• 影响膜相行为： 根据脂质组成及温度条件，改变脂质相态和分子运动特征。

• 调控颗粒结构： 影响LNP内部脂质分布、界面结构及形貌均一性。

• 影响颗粒稳定性： 改变脂质重新排列、聚集及结构重组的倾向。

• 间接影响核酸递送： 通过改变颗粒结构、细胞摄取及胞内释放行为，影响终递送效果。

需要注意的是，胆固醇的作用具有明显的配方依赖性，并非含量越高，LNP的稳定性和递送效率就一定越好。

二、胆固醇含量变化对LNP颗粒形貌的影响

LNP颗粒形貌是评价递送体系结构特征的重要指标。颗粒是否呈现近球形、是否存在结构异质性，以及是否出现非典型脂质聚集体，都可能与胆固醇含量变化有关。

1. 胆固醇含量较低时：脂质堆积状态可能发生变化

当胆固醇比例较低时，LNP内部脂质排列主要由可离子化脂质和辅助磷脂等组分主导。

在部分配方中，胆固醇含量不足可能降低某些脂质结构的有序性或稳定性，使颗粒更容易发生内部结构重排。然而，这并不意味着低胆固醇配方一定形成不规则颗粒。

其可能表现为颗粒形貌异质性增加、粒径分布发生变化，或在储存和环境应力作用下出现结构变化。

这些现象与可离子化脂质分子形状、辅助磷脂相态、核酸类型及制备条件密切相关。

2. 胆固醇含量适中时：有利于形成协调的脂质堆积结构

在某些经过优化的LNP配方中，适当比例的胆固醇能够改善脂质分子之间的堆积协调性，使颗粒形成较为稳定的内部组织结构。

这可能有助于提高颗粒形貌均一性，减少不利的脂质相分离，并改善部分储存条件下的结构保持能力。

但这种改善并不是普遍规律。不同可离子化脂质体系对胆固醇的需求存在差异，良好比例应通过实验确定。

3. 胆固醇含量过高时：可能诱发脂质相分离或结构异质性

当胆固醇比例持续增加时，其在特定脂质混合体系中的相容性可能受到限制。

部分配方可能出现胆固醇富集区域、胆固醇晶体或其他非均一脂质结构，导致颗粒内部组织和外部形貌发生变化。

在实验中，这些变化可能表现为异常颗粒群体增加、形貌差异扩大或颗粒聚集趋势增强。

但高胆固醇比例不一定导致颗粒失稳。是否出现上述现象取决于整体配方组成及制备条件。

三、胆固醇含量对LNP粒径及粒径分布的影响

粒径和多分散指数（Polydispersity Index，PDI）是LNP质量评价中常用的理化指标。

LNP粒径不仅与脂质配方有关，还受到混合速度、脂质浓度、水相与有机相比例、核酸浓度及后处理工艺的影响。

胆固醇通过调节脂质分子之间的相互作用，可能影响颗粒成核、生长及组装过程。

在不同体系中，随着胆固醇含量增加，LNP平均粒径可能减小、增大或呈现非单调变化。因此，不能简单地将胆固醇含量与颗粒粒径建立固定的正相关或负相关关系。

此外，PDI能够反映颗粒群体的粒径分布宽度。对于需要严格控制批次一致性的LNP制剂而言，除了平均粒径，还应关注是否存在少量大颗粒、颗粒聚集体以及不同批次间的分布差异。

建议在配方筛选过程中同时记录粒径、PDI和颗粒形貌，避免仅凭单一粒径指标判断胆固醇比例是否合理。

四、胆固醇含量对LNP颗粒稳定性的影响

LNP稳定性是决定核酸递送制剂质量、储存条件及应用可行性的重要因素。通常可以从物理稳定性、化学稳定性和核酸载荷稳定性三个方面进行评价。

1. 对物理稳定性的影响

LNP的物理稳定性主要表现为颗粒在储存和使用过程中能否维持相对稳定的粒径、分布状态及内部结构。

胆固醇能够影响脂质分子之间的相互作用，因此可能改变颗粒在储存过程中的聚集、融合及结构重组行为。

已有研究比较了含有10%、20%和40%胆固醇的mRNA-LNP体系。结果表明，低胆固醇含量的LNP虽然能够成功形成颗粒，但在4℃储存一周的观察中，部分10 mol%胆固醇配方的稳定性低于20 mol%和40 mol%配方。

这一结果说明，胆固醇不仅影响LNP初始组装，也可能影响颗粒在储存过程中的结构保持能力。

2. 对化学稳定性的影响

LNP化学稳定性涉及脂质水解、氧化及其他降解反应。

胆固醇本身也可能发生氧化，其氧化产物可能改变脂质体系的理化性质。因此，不能简单地认为增加胆固醇比例就能够提高LNP的化学稳定性。

实际开发过程中，需要结合脂质原料纯度、氧化杂质、缓冲液组成、溶解氧、温度及包装条件进行综合评价。

对于长期储存的LNP制剂，还应关注胆固醇含量变化是否会影响其他脂质组分的降解行为，以及是否导致颗粒内部结构发生不可逆变化。

3. 对核酸包封及载荷稳定性的影响

核酸包封效率是LNP制剂的重要质量属性。

胆固醇通常并不直接承担核酸静电复合的主要功能，但它可以通过影响颗粒内部脂质组织结构，间接改变核酸的包封状态及储存期间的保持能力。

在部分低胆固醇配方中，随着储存时间延长，可能出现粒径增大及核酸包封效率下降的现象。

因此，评价胆固醇含量对核酸稳定性的影响时，不仅需要测定初始包封效率，还应监测储存期间游离核酸比例、核酸完整性以及生物学活性变化。

五、胆固醇含量对LNP内部结构及递送效率的影响

胆固醇对LNP的影响并不局限于颗粒外部形貌，其对内部脂质排列和胞内递送过程的调控同样值得关注。

研究发现，不同甾醇结构能够改变LNP颗粒形貌及细胞内运输行为。

例如，发表于 Nature Communications 的研究表明，采用部分天然植物甾醇替代胆固醇后，LNP可由相对球形结构转变为多面体形貌，同时表现出不同的细胞摄取和胞内运输特征。

需要强调的是，这项研究考察的是胆固醇类似物替代效应，并非单纯增加或减少胆固醇含量，但它说明甾醇分子结构能够显著影响LNP形貌与功能。

此外，胆固醇比例还可能影响LNP在不同组织中的递送表现。不同组织的细胞摄取途径、内体环境及蛋白表达特征存在差异，因此在某一种细胞模型中表现较好的胆固醇比例，不一定适用于其他组织或给药途径。

这也意味着，LNP配方优化不能只关注颗粒粒径或包封效率，还需要将实际递送效果纳入综合评价体系。

六、不同胆固醇含量下LNP的典型变化趋势

下表总结了不同胆固醇比例可能产生的影响，适用于配方研究中的初步分析。

注：上述为机制性归纳，不代表所有LNP配方的必然实验结果。不同含量区间的具体边界取决于脂质组成及工艺条件。

一项针对不含核酸的LNP开展的研究发现，胆固醇含量在0%至38.5%的部分配方中，颗粒主要表现为球形；当胆固醇含量达到58.5%时，部分颗粒出现非完全球形及近似直线的边缘特征。

这一现象提示，胆固醇比例过高时可能改变颗粒形貌，但其具体结果仍需要结合载荷类型和脂质配方进行验证。

七、胆固醇含量对LNP形貌与稳定性的实验表征方法

为了系统分析胆固醇含量变化的影响，建议结合多种检测技术开展研究。

此外，还可以结合脂质组成分析、核酸完整性检测及细胞转染实验，建立从理化性质到生物学功能的综合评价体系。

 

八、胆固醇含量优化的实验设计思路

为了明确胆固醇比例对LNP性能的影响，可以采用梯度配方设计开展系统研究。

例如，在固定可离子化脂质、PEG脂质、核酸种类及主要制备工艺参数的基础上，设置不同胆固醇摩尔百分比，并通过相应调整辅助磷脂比例保持总脂质摩尔百分比为100%。

以下为示例性研究设计：

以上比例仅为实验筛选示例，并非推荐的通用优配方。50 mol%组尤其需要关注胆固醇相容性及潜在结晶风险。

实验中建议重点控制以下变量：

• 配方变量： 保持可离子化脂质及PEG脂质比例相对固定，明确胆固醇与辅助磷脂的替代关系。

• 工艺变量： 控制总脂质浓度、核酸浓度、N/P比、混合条件及缓冲液组成。

• 表征指标： 检测粒径、PDI、Zeta电位、核酸包封效率和颗粒形貌。

• 稳定性指标： 比较不同储存时间点的粒径变化、聚集情况、核酸完整性和功能保持率。

• 生物学指标： 结合目标细胞或组织模型，评价核酸递送效率及细胞相容性。

通过多指标联合分析，可以进一步判断胆固醇含量与LNP结构及稳定性之间是否存在非线性关系。

在条件允许的情况下，还可采用实验设计法（Design of Experiments，DoE），同时考察胆固醇比例与辅助磷脂类型、可离子化脂质结构之间的交互作用，提高配方优化效率。

九、胆固醇含量优化对LNP研发的实际意义

胆固醇含量优化不仅是一项基础配方研究工作，也直接关系到LNP制剂的开发效率和质量控制。

首先，合理调节胆固醇比例有助于筛选具有良好颗粒均一性和储存稳定性的候选配方，减少后续工艺放大过程中因结构不稳定而产生的质量风险。

其次，胆固醇比例与脂质组成之间存在复杂的相互作用。通过系统研究，可以进一步理解不同脂质组分在颗粒组装过程中的协同机制，为新型可离子化脂质及功能化递送体系的设计提供依据。

此外，LNP的理化性质与实际递送效果之间并不存在简单的一一对应关系。粒径较小或PDI较低的配方，并不一定具有高的核酸表达效率。

因此，配方优化应从单一理化指标导向逐步转向结构、稳定性、递送效率及安全性的综合评价。

十、总结与展望

胆固醇是影响脂质纳米颗粒结构与性能的重要配方组分之一，其含量变化能够通过调节脂质分子排列、内部相态及分子间相互作用，进一步影响LNP颗粒形貌、粒径分布和储存稳定性。

现有研究表明，适当的胆固醇比例有助于维持部分LNP体系的结构稳定性；胆固醇含量不足可能导致储存期间颗粒性质变化，而过高的胆固醇比例则可能增加脂质相分离或异常结构形成的风险。

然而，胆固醇并不存在适用于所有LNP体系的统一良好含量。 其作用与可离子化脂质结构、辅助磷脂类型、核酸载荷、制备工艺及应用场景密切相关。

未来，随着Cryo-TEM、SAXS及多维度脂质分析技术的发展，研究人员有望进一步揭示胆固醇在LNP内部的分布规律及其与核酸递送行为之间的关系。

对于LNP研发而言，通过系统性的配方筛选、结构表征与稳定性评价，建立胆固醇含量、颗粒微观结构和递送功能之间的关联，将为开发更加稳定、高效且具有良好可制造性的核酸药物递送体系提供重要支持。

参考文献

1. Kawaguchi等，Effect of Cholesterol Content of Lipid Composition in mRNA-LNPs on the Protein Expression in the Injected Site and Liver After Local Administration in Mice. 

2. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications, 2020. 

3. The Effect of Cholesterol Content on the Adjuvant Activity of Nucleic-Acid-Free Lipid Nanoparticles. Pharmaceutics, 2024. 

4. Comprehensive analysis of lipid nanoparticle formulation and preparation for RNA delivery.