脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles，LNP）是核酸药物递送领域的重要载体，其表面性质直接影响颗粒稳定性、蛋白吸附、细胞摄取以及体内分布行为。
在LNP配方中，聚乙二醇修饰脂质（PEG-lipid）通常用于改善颗粒的胶体稳定性，并通过形成亲水性水化层减少部分非特异性相互作用。然而，PEG-脂质并非永久固定在LNP表面。当颗粒进入含有血清蛋白和脂蛋白的生物环境后，PEG-脂质可能逐渐从LNP表面解离，并向其他脂质结构转移。
37°C血清孵育实验是评价PEG-脂质在近生理温度和含蛋白环境下表面保留行为的一种常用体外研究方法。
通过监测不同孵育时间点的PEG保留率，可以比较不同PEG-脂质材料的锚定稳定性，并分析其与LNP粒径变化、蛋白冠形成及细胞递送效率之间的关系。
需要注意，37°C血清孵育并不完全等同于真实血液循环。血清缺少部分凝血相关成分，且体外体系不包含血流动力学、组织摄取和体内清除等过程，因此实验结果主要用于体外配方比较及机制研究。
一、什么是PEG保留率？
PEG保留率通常是指在特定孵育条件下，仍然与LNP颗粒结合的PEG-脂质量占初始LNP结合PEG-脂质量的比例。
它能够反映PEG-脂质在一定实验条件下的表观锚定稳定性。
在经过验证的定量分析条件下，PEG保留率可表示为：
其中：
-
\(M_{\mathrm{LNP},0}\)：孵育前与LNP结合的PEG-脂质量。
-
\(M_{\mathrm{LNP},t}\)：孵育时间为t时仍与LNP结合的PEG-脂质量。
这一计算方法适用于明确以初始样品为基准的保留率分析。如果研究目标是比较每个剩余LNP颗粒的PEG覆盖程度，则还需要结合颗粒数量、颗粒回收率或其他适当的归一化指标。
在实际实验中，PEG保留率下降可能与PEG-脂质脱附、颗粒损失或样品分离过程中的交换有关。因此，需要合理设置回收率和分析方法对照，避免将全部PEG信号下降直接归因于脱附。
二、37°C血清环境为什么会促进PEG-脂质动态交换？
在37°C条件下，脂质分子的运动及其与周围生物组分的相互作用可能更加活跃。与此同时，血清中的脂蛋白和其他蛋白质为PEG-脂质的交换、吸附及重新分布提供了复杂环境。
血清环境中的主要影响因素
- 温度对分子运动的影响
37°C接近人体正常生理温度。相较于4°C，部分PEG-脂质体系可能表现出更快的分子交换动力学，但具体变化还受到脂质相态、锚链结构及颗粒组成影响。
- 脂蛋白参与脂质交换
血清中的HDL、LDL等脂蛋白具有脂质结合和运输能力。在适宜条件下，部分PEG-脂质可以从LNP表面转移至这些脂质组分，改变LNP表面的PEG覆盖状态。
- 蛋白冠形成与表面重构
血清蛋白可吸附于LNP表面，形成动态蛋白冠。PEG覆盖程度变化可能影响蛋白吸附，而蛋白冠反过来也可能改变PEG-脂质的可接近性及颗粒表面行为。
因此，37°C血清孵育实验研究的不仅是PEG-脂质的物理脱附，还涉及脂质交换、蛋白吸附和纳米颗粒表面结构变化等过程。
三、不同PEG-脂质结构对37°C血清保留率的影响
PEG-脂质通常由PEG亲水链、连接结构和疏水锚定基团构成。其中，疏水锚链的长度与结构是影响PEG-脂质表面保留能力的重要因素。
常见PEG-脂质材料对比
|
材料类型 |
疏水锚定结构 |
37°C血清中一般保留趋势 |
主要研究特点 |
|---|---|---|---|
|
DMG-PEG2000 |
C14双链 |
相对较低 |
适用于研究较快的PEG动态交换 |
|
DSPE-PEG2000 |
C18磷脂双链 |
通常较高 |
具有较强的疏水锚定能力 |
|
DSG-PEG2000 |
C18双链 |
通常较高 |
可用于研究较慢的PEG脱附行为 |
|
可裂解PEG-脂质 |
结构依设计而异 |
可调控 |
适用于刺激响应型PEG释放研究 |
说明：以上属于结构层面的定性趋势，并非同一实验体系中的实测PEG保留率。不同LNP配方、血清浓度和检测方法可能改变比较结果。
为什么C14与C18锚链存在差异？
较短的C14疏水链通常具有相对较弱的疏水锚定作用，因此在含脂质交换受体的环境中，DMG-PEG2000可能更容易从LNP表面解离。
相比之下，DSPE-PEG2000和DSG-PEG2000具有较长的C18双链结构，通常更不容易从脂质环境中脱附。
不过，PEG-脂质的保留能力并非只由碳链长度决定。连接基团、脂质链饱和程度、LNP内部脂质排列及血清蛋白组成也可能改变实际保留行为。
四、PEG保留率随血清孵育时间的变化规律
在实验中，PEG保留率通常需要通过多个时间点的测定建立动态变化曲线。
对于某些体系，PEG保留率可能随孵育时间逐渐下降，并在一定条件下呈现接近指数衰减的趋势。
不同脱附速度下的PEG保留率变化
从模型可以看出，在初始PEG覆盖程度相同的条件下，脱附速度越快，颗粒表面PEG保留率下降越明显。
但真实血清环境中的PEG-脂质交换可能并不完全符合单指数模型。例如，LNP表面可能存在不同结合状态的PEG-脂质，血清脂蛋白的交换能力也可能随时间变化。
因此，实际实验中可根据数据拟合效果选择适当的动力学模型，避免直接将理论半衰期视为材料的固有常数。
五、PEG保留率变化对LNP稳定性及递送性能的影响
PEG保留率的变化可能通过多种途径影响LNP的体外稳定性及后续细胞递送行为。
PEG保留率越高，递送效果一定越好吗？
并不一定。
较高的PEG保留率可能有助于维持LNP表面水化层，降低部分非特异性相互作用。但持续的PEG屏蔽也可能限制LNP与细胞膜之间的直接接触。
相反，适当的PEG脱附可能使部分LNP更容易参与细胞摄取，但如果脱附过快，也可能增加颗粒聚集、非特异性蛋白吸附或其他不利影响。
因此，PEG保留率的优化需要综合考虑稳定性和递送效率，而不是单纯追求高保留率。
六、37°C血清孵育实验如何设计？
为了系统比较不同PEG-脂质的锚定稳定性，可以在控制LNP基础配方一致的条件下，设置不同PEG-脂质材料及孵育时间梯度。
实验方案参考
|
实验项目 |
建议研究条件 |
|---|---|
|
PEG-脂质类型 |
DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DSG-PEG2000 |
|
孵育温度 |
37°C |
|
血清条件 |
选择适宜血清来源及浓度，并明确记录 |
|
时间梯度 |
0、15、30分钟及1、2、4、8、24小时 |
|
对照组 |
无血清缓冲液孵育组 |
|
主要指标 |
PEG保留率、粒径、PDI、蛋白吸附 |
|
补充指标 |
RNA完整性、包封率、细胞递送效率 |
检测方法与分析要点
荧光标记法： 可采用适当标记的PEG-脂质，结合颗粒分离手段，检测LNP结合组分中的荧光变化。需确认荧光标记不会显著改变PEG-脂质的交换行为。
色谱分析法： 可利用液相色谱或其他适宜的分离技术，区分PEG-脂质与不同血清组分，并进行定量分析。
质谱分析法： 对于具备合适检测条件的PEG-脂质，可采用质谱方法分析其结构完整性及不同组分中的分布。
颗粒表征： 通过动态光散射检测粒径及PDI变化，并结合其他方法观察颗粒聚集或结构变化。
在实验设计中，应特别关注血清背景干扰。血清本身含有蛋白质和脂蛋白，可能影响DLS结果及颗粒分离效率，因此应设置血清空白组、方法回收率对照及适当的分析验证。
七、瑞禧生物PEG-脂质材料在血清稳定性研究中的应用方向
围绕瑞禧生物相关PEG-脂质材料，可以从材料结构、修饰比例和递送性能三个层面开展研究。
- PEG-脂质结构筛选
对比不同锚链长度及连接结构的PEG-脂质，分析其在37°C血清中的保留率和表观脱附动力学，建立材料结构与锚定能力之间的关联。
- PEG修饰比例优化
在固定其他LNP组分的条件下，研究PEG-脂质初始摩尔比例对颗粒稳定性、血清蛋白吸附及细胞摄取行为的影响。
- PEG保留率与递送功能关联
将血清孵育后的PEG保留率与RNA包封率、细胞摄取及蛋白表达效率进行联合分析，探索适合特定核酸递送体系的PEG-脂质材料。
对于不同PEG-脂质材料的实际应用，应进一步结合产品纯度、PEG分子量分布、脂质连接结构及储存条件等因素进行综合评价。
八、研究总结与展望
37°C血清孵育条件下的PEG保留率，是评价PEG-脂质在生物相关环境中表面锚定稳定性的重要指标。
不同PEG-脂质由于疏水锚链结构及连接方式不同，可能表现出不同的脱附与交换行为。一般而言，具有较短疏水链的PEG-脂质在部分体系中更容易发生交换，而较长的疏水锚链通常具有较强的表面保留潜力。
但PEG保留率并不能单独决定LNP的递送效果。蛋白冠形成、颗粒稳定性、细胞摄取和核酸释放等因素均会影响终的生物学表现。
未来LNP配方优化的重点，应从单纯提高PEG表面保留率，转向实现PEG动态脱附、颗粒稳定性与有效递送之间的合理平衡。
对于瑞禧生物相关PEG-脂质材料的科研应用，通过建立标准化的37°C血清孵育评价体系，并结合PEG定量分析和功能性递送实验，有望为LNP配方筛选、材料选择及纳米药物递送研究提供更加可靠的技术依据。
参考文献
-
Mui, B. L., et al. (2013). Influence of Poly(ethylene glycol) Lipid Desorption Rates on Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of siRNA Lipid Nanoparticles. Molecular Therapy—Nucleic Acids, 2, e139. DOI: 10.1038/mtna.2013.66.
-
Hou, X., Zaks, T., Langer, R., & Dong, Y. (2021). Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials, 6, 1078–1094. DOI: 10.1038/s41578-021-00358-0.
-
Suk, J. S., et al. (2016). PEGylation as a strategy for improving nanoparticle-based drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 99, 28–51. DOI: 10.1016/j.addr.2015.09.012.