一、脂质体表面功能化修饰的重要性

在多肽与脂质体的偶联过程中，如何将多肽稳定地连接到脂质体表面，同时尽可能保持其生物识别能力，是影响功能化脂质体性能的重要因素。

**DSPE-PEG-MAL（马来酰亚胺聚乙二醇磷脂）**是一类常用的双功能磷脂聚合物，能够利用疏水磷脂结构嵌入脂质膜，并通过PEG末端的马来酰亚胺基团与含巯基多肽发生共价偶联，从而实现脂质体表面的功能化修饰。

本文围绕瑞禧生物DSPE-PEG-MAL相关材料的应用场景，系统介绍其结构特点、反应机理、制备策略、关键工艺参数及表征方法，为靶向脂质体的设计与优化提供技术参考。

二、DSPE-PEG-MAL的分子结构与功能特点

2.1 DSPE-PEG-MAL的基本组成

DSPE-PEG-MAL主要由三个功能部分构成：

1. DSPE疏水磷脂锚定基团

DSPE全称为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，具有两条C18饱和脂肪酰链。

这种双长链疏水结构能够通过疏水相互作用插入脂质体膜内，使PEG功能链段固定于脂质体表面。

相较于采用较短疏水链的PEG脂质，DSPE结构通常具有较强的脂质膜锚定能力，有利于降低PEG脂质从脂质膜中脱离的倾向。

需要注意，DSPE-PEG-MAL在脂质体中的实际保留情况仍受到脂质组成、胆固醇含量、膜流动性、温度及外部介质等因素影响。

2. PEG亲水连接链段

PEG是连接DSPE与马来酰亚胺功能基团的亲水性聚合物链。

在脂质体表面，PEG链能够形成一定的空间位阻层，减少颗粒间直接接触，并在一定程度上调节血浆蛋白吸附及脂质体与细胞膜之间的相互作用。

同时，PEG链还可作为多肽配体与脂质膜之间的柔性连接臂，使多肽远离脂质膜表面，降低膜表面空间阻碍对配体识别能力的影响。

常见研究材料包括DSPE-PEG2000-MAL、DSPE-PEG3400-MAL及DSPE-PEG5000-MAL等不同PEG分子量的衍生物。

其中，DSPE-PEG2000-MAL是脂质体表面巯基配体偶联研究中较常见的选择。

3. MAL马来酰亚胺反应基团

MAL是DSPE-PEG-MAL分子末端的活性功能基团。

马来酰亚胺环具有能够与巯基发生Michael加成反应的活性双键。在适宜的缓冲液条件下，可与多肽中的游离巯基反应，形成共价连接结构。

这种反应通常无需额外的金属催化剂，能够在相对温和的水相条件下进行，因此适用于多种对反应环境较敏感的生物分子。

2.2 DSPE-PEG-MAL在脂质体中的作用

DSPE-PEG-MAL具有脂质膜锚定和表面化学偶联的双重功能。

一方面，DSPE基团插入脂质双层，为PEG及末端功能基团提供膜表面锚定基础。

另一方面，PEG末端的MAL基团可作为化学反应位点，使含巯基多肽通过共价方式连接到脂质体表面。

因此，DSPE-PEG-MAL既是脂质体表面修饰材料，也是构建靶向脂质体的重要连接组分。

三、DSPE-PEG-MAL与巯基多肽的偶联反应机理

3.1 巯基与马来酰亚胺的Michael加成反应

DSPE-PEG-MAL与巯基多肽的偶联主要依赖巯基-马来酰亚胺Michael加成反应。

其反应过程可简化表示为：

DSPE-PEG-MAL + HS-Peptide → DSPE-PEG-MAL-S-Peptide

其中：

• DSPE-PEG-MAL代表具有马来酰亚胺末端的功能化磷脂。

• HS-Peptide代表含有游离巯基的多肽。

• 反应产物中的多肽通过含硫共价连接结构与PEG末端结合。

从化学结构上看，该反应生成的是硫代琥珀酰亚胺型加成产物。

与普通非共价吸附相比，共价偶联能够减少多肽从PEG末端直接解离的可能性。

不过，初始形成的马来酰亚胺-巯基加成结构在某些生物环境中仍可能发生逆Michael反应或硫醇交换，因此不能简单认为其在所有条件下均完全不可逆。

3.2 巯基多肽的结构设计

在脂质体靶向修饰研究中，常通过在多肽N端或C端引入半胱氨酸（Cys），提供可参与偶联反应的巯基。

例如：

Cys-Gly-Gly-Targeting Peptide

或：

Targeting Peptide-Gly-Gly-Cys

其中，半胱氨酸残基提供巯基反应位点，甘氨酸等柔性氨基酸可作为连接间隔。

这种设计能够在一定程度上减少偶联反应对多肽核心识别序列的影响。

对于具有天然半胱氨酸残基的多肽，应特别关注这些半胱氨酸是否参与二硫键形成。

如果多肽依赖二硫键维持活性构象，直接还原二硫键可能破坏其天然结构和生物活性。

因此，优先考虑在不影响活性结构的位置引入独立的游离半胱氨酸位点。

3.3 反应选择性及其影响因素

巯基-马来酰亚胺反应通常在弱酸性至近中性环境中具有较好的化学选择性。

常用反应pH范围为6.5—7.5。

在该范围内，巯基能够与马来酰亚胺发生较快的加成反应，而与部分其他亲核基团的竞争反应相对有限。

当pH过低时，巯基去质子化程度降低，可能使反应速率下降。

当pH偏高时，马来酰亚胺环水解速度可能增加，导致活性双键被破坏，降低偶联效率。

因此，合理控制反应pH是提高DSPE-PEG-MAL偶联效率的重要条件。

四、DSPE-PEG-MAL功能化脂质体的主要制备策略

4.1 预插入法

预插入法是指在脂质体形成之前，将DSPE-PEG-MAL与其他脂质组分共同混合，再通过薄膜水化、挤出或其他工艺制备脂质体。

其基本流程为：

脂质组分混合 → 脂质体形成 → 粒径调节 → 加入巯基多肽 → 偶联反应 → 纯化

这种方法操作路线相对直接，能够在脂质体形成过程中引入功能化磷脂。

但预插入法存在一个值得关注的问题：部分MAL基团可能分布于脂质体内侧膜表面，无法与外部多肽直接接触。

此外，脂质体制备过程中经历的水化、加热及纯化步骤，也可能导致部分MAL基团发生水解。

因此，实际可参与偶联的MAL数量不一定等于配方中加入的DSPE-PEG-MAL总量。

4.2 后插入法

后插入法通常先制备基础脂质体，再将DSPE-PEG-MAL通过适当方式引入已形成的脂质体膜中。

其基本流程为：

基础脂质体制备 → DSPE-PEG-MAL后插入 → 去除未插入组分 → 巯基多肽偶联 → 纯化与表征

后插入法有助于将部分功能化PEG脂质引入脂质体外表面，并减少MAL基团在初始脂质体制备过程中受到的水相处理影响。

但后插入效率受到温度、脂质组成、膜相态及DSPE-PEG-MAL聚集状态等因素影响。

此外，游离DSPE-PEG-MAL胶束可能与脂质体共同存在，必须通过适当的分离与定量手段加以区分。

4.3 先偶联后插入法

另一种研究策略是先在溶液或适宜的分散体系中制备DSPE-PEG-多肽偶联物，再将其引入脂质体膜中。

其基本流程为：

DSPE-PEG-MAL + 巯基多肽 → DSPE-PEG-多肽 → 纯化 → 脂质体后插入

这种方式有利于在脂质体修饰之前，对偶联物的组成与纯度进行分析。

但是，DSPE-PEG-多肽可能形成胶束或其他聚集结构，其插膜效率也可能受到多肽疏水性、分子尺寸及脂质体膜性质影响。

因此，应根据多肽结构和终脂质体性能要求选择适合的制备路线。

五、巯基多肽偶联过程中的关键技术参数

5.1 反应pH控制

反应pH直接影响马来酰亚胺基团的化学稳定性和巯基反应活性。

通常可选择pH 6.5—7.5作为初始优化范围，并根据多肽溶解性及反应效率进一步调整。

对于容易氧化或结构较敏感的多肽，可以从pH 6.8—7.0附近开展小规模条件筛选。

应尽量避免长时间将未反应的DSPE-PEG-MAL暴露于偏碱性的水溶液中。

5.2 缓冲体系选择

常见的反应缓冲体系包括磷酸盐缓冲液及HEPES缓冲液。

缓冲体系应具有适当的离子强度，并与多肽结构、脂质体稳定性及后续分析方法兼容。

在偶联反应过程中，应避免加入含游离巯基的组分，例如半胱氨酸、谷胱甘肽或DTT，因为这些物质可能竞争性消耗MAL反应位点。

对于需要还原处理的多肽，应在偶联前评估还原剂的去除程度，并通过适当方法确认游离巯基含量。

5.3 反应温度与时间

巯基-马来酰亚胺偶联通常可以在室温附近进行。

对于多数初步研究，可将20—25℃作为起始温度范围，并设置不同反应时间进行比较。

反应时间可从30分钟、1小时、2小时及4小时等条件进行筛选。

实际反应时间应根据多肽结构、反应物浓度及表面MAL可及性确定，而不宜直接采用固定条件。

如果多肽对温度较敏感，可进一步研究较低温度条件下的偶联效率。

5.4 DSPE-PEG-MAL与巯基多肽的投料比例

反应投料比例是影响多肽偶联密度的重要因素。

需要特别区分以下三个概念：

第一，DSPE-PEG-MAL在脂质体配方中的总摩尔百分比。

第二，实际暴露在脂质体外表面、仍具有反应活性的MAL数量。

第三，终成功连接到脂质体表面的多肽数量。

这三个数值通常并不相同。

因此，不建议仅根据DSPE-PEG-MAL的理论投料量计算偶联效率。

对于初始工艺筛选，可根据测得的有效MAL含量，设计不同巯基与MAL摩尔比例，并考察多肽利用率及终表面配体密度。

5.5 多肽巯基氧化问题

游离巯基容易在一定条件下发生氧化，形成二硫键。

如果两个含巯基多肽分子发生氧化偶联，就可能形成多肽二聚体，使可参与MAL反应的游离巯基减少。

因此，应尽量使用新鲜配制的巯基多肽溶液，并根据实际情况控制氧化暴露。

对于需要还原处理的多肽，应优先确认还原过程是否影响其构象和活性。

可采用Ellman试剂等方法测定游离巯基含量，辅助判断多肽是否适合进入偶联步骤。

六、DSPE-PEG-MAL修饰密度对脂质体性能的影响

6.1 对脂质体粒径与分散性的影响

DSPE-PEG-MAL插入脂质膜后，会改变脂质体表面的亲水层结构。

在适宜的修饰范围内，PEG链可能有助于减少脂质体间的非特异性相互作用。

但当DSPE-PEG-MAL比例较高时，也可能改变膜堆积状态，并在某些配方中促进胶束形成或影响脂质体结构。

因此，不能简单认为DSPE-PEG-MAL添加量越高，脂质体稳定性就越好。

建议在不同修饰比例下检测脂质体粒径、PDI及储存稳定性。

6.2 对多肽表面密度的影响

提高DSPE-PEG-MAL投料量，理论上能够增加可供多肽偶联的反应位点。

但随着表面配体密度增加，PEG链之间及多肽之间的空间位阻可能增强。

当多肽分子较大或具有较复杂的空间构象时，过高的表面密度可能影响配体暴露程度。

因此，多肽偶联密度与靶向识别能力之间不一定呈简单的线性关系。

6.3 对细胞识别与摄取的影响

多肽修饰脂质体的设计目标通常是增强其与特定细胞表面受体之间的相互作用。

例如，RGD类多肽可用于研究特定整合素受体相关的靶向递送，其他受体识别多肽也可用于不同组织或细胞模型。

然而，多肽成功偶联并不意味着脂质体一定能够实现高效靶向递送。

实际递送性能还受到多肽空间取向、受体表达水平、脂质体粒径、蛋白冠形成及细胞内转运等因素影响。

因此，应通过受体表达差异细胞模型、游离多肽竞争实验及细胞摄取实验，验证靶向作用是否具有特异性。

七、DSPE-PEG-MAL偶联脂质体的质量评价方法

7.1 粒径及PDI检测

采用动态光散射（DLS）测定脂质体的平均水合粒径及多分散指数。

通过比较偶联前后的粒径变化，可以初步判断表面修饰是否影响脂质体的胶体状态。

需要注意，粒径变化不能单独证明多肽已经成功偶联。

7.2 Zeta电位检测

Zeta电位能够反映脂质体在特定分散介质中的电动学表面性质。

当偶联多肽带有正电荷或负电荷时，脂质体Zeta电位可能发生变化。

但该变化也会受到PEG屏蔽效应、缓冲液离子强度及脂质体原始组成影响，因此只能作为辅助表征指标。

7.3 游离巯基检测

Ellman试剂可用于检测体系中的游离巯基。

通过对偶联前后游离巯基含量进行比较，可以辅助分析巯基消耗情况。

但游离巯基减少也可能来自氧化或其他副反应，因此不能仅凭巯基消耗量确定共价偶联效率。

7.4 多肽偶联效率测定

可采用HPLC、荧光定量、LC-MS或其他适合的分析方法，测定反应前后游离多肽及颗粒结合态多肽的含量。

偶联效率可根据实际测定结果计算：

偶联效率（%）＝（成功偶联的多肽摩尔量 / 初始投入的多肽摩尔量）×100%

在实际测定中，应区分共价偶联多肽、非特异性吸附多肽及游离多肽。

必要时可结合尺寸排阻色谱、超滤及其他正交分析手段进行验证。

7.5 形貌与膜结构表征

可采用透射电子显微镜或冷冻透射电子显微镜观察脂质体形貌。

对于对膜完整性要求较高的体系，还应关注偶联反应前后的包封率、药物泄漏情况及膜结构变化。

7.6 生物学功能验证

如果多肽用于受体靶向研究，建议开展细胞摄取、受体竞争及相关功能实验。

对于载药脂质体，还应进一步评价药物释放、细胞毒性及功能性递送效果。

只有结合化学表征、胶体性质及生物学功能验证，才能较全面地评价多肽修饰脂质体的实际性能。

八、DSPE-PEG-MAL应用中的常见问题及解决思路

8.1 多肽偶联效率偏低

可能原因包括：

• MAL基团在制备过程中发生水解。

• 多肽游离巯基发生氧化。

• 反应pH不适宜。

• PEG链或表面配体产生空间位阻。

• 脂质体表面有效MAL含量不足。

优化时应优先检测有效MAL与游离巯基含量，再调整反应时间、投料比例及缓冲条件。

8.2 偶联后脂质体出现聚集

可能与多肽表面电荷、疏水性、局部高密度修饰及反应体系离子强度有关。

可通过降低修饰密度、调整缓冲体系或优化纯化工艺进行研究。

同时，应排查游离多肽、游离PEG脂质胶束及多肽聚集体对检测结果的影响。

8.3 多肽偶联成功但靶向效果不明显

此类情况不一定是化学反应失败。

可能原因包括多肽活性构象受到影响、配体被PEG链遮挡、细胞受体表达不足，或者脂质体与细胞之间存在其他非特异性相互作用。

因此，建议在偶联效率测定之外，进一步验证多肽的受体结合能力和靶向特异性。

8.4 长期储存后偶联活性下降

DSPE-PEG-MAL中的马来酰亚胺基团对水相环境及pH具有一定敏感性。

如果材料长期暴露于水溶液中，部分MAL基团可能逐渐失去反应活性。

因此，应根据具体产品说明书选择储存条件，并尽量避免不必要的水相暴露、反复冻融及长时间高温处理。

对于已完成多肽偶联的脂质体，还需要分别考察脂质体胶体稳定性、脂质锚定保留情况以及多肽连接结构的化学稳定性。

九、DSPE-PEG-MAL在靶向脂质体研究中的应用方向

9.1 肿瘤靶向脂质体

通过DSPE-PEG-MAL将具有肿瘤相关受体识别能力的多肽连接到脂质体表面，可用于构建肿瘤靶向纳米递送系统。

研究中可结合细胞受体表达、配体密度及脂质体摄取行为，评价多肽修饰对递送性能的影响。

9.2 核酸递送系统

DSPE-PEG-MAL也可用于部分核酸脂质载体的表面配体修饰研究。

例如，在适宜的脂质纳米颗粒体系中引入含巯基靶向多肽，以研究其对细胞识别及组织分布的影响。

需要注意，核酸LNP与传统磷脂双层脂质体的结构可能存在明显差异，因此DSPE-PEG-MAL的插入效率、锚定行为及对递送活性的影响需要单独验证。

9.3 细胞靶向及受体介导递送

利用不同受体识别多肽，可设计具有特定细胞识别功能的脂质体。

相关研究可用于探索脂质体与免疫细胞、内皮细胞或其他目标细胞之间的相互作用。

9.4 荧光成像与诊疗一体化

将功能性多肽与荧光标记脂质体结合，可用于研究纳米颗粒的细胞摄取、胞内分布及组织定位。

通过整合药物载荷、成像组分和表面识别配体，还可进一步探索诊疗一体化纳米载体。

十、瑞禧生物DSPE-PEG-MAL材料的选型建议

在使用瑞禧生物DSPE-PEG-MAL开展脂质体表面多肽偶联研究时，建议重点关注以下几个方面。

第一，明确PEG分子量。

DSPE-PEG2000-MAL通常可作为初始研究材料。对于分子尺寸较大或需要更长柔性连接臂的多肽，可以进一步比较其他PEG链长。

第二，确认MAL末端活性。

材料的标称组成并不完全等同于实际可反应的MAL含量。对于偶联效率要求较高的研究，建议结合供应商质量资料和实验检测确认功能基团状态。

第三，根据脂质体配方选择插入策略。

对于需要保留较高MAL反应活性的体系，可以比较预插入、后插入及先偶联后插入等不同路线。

第四，优化多肽结构设计。

优先采用具有明确游离巯基位点的多肽，并尽量避免偶联反应破坏其核心生物活性结构。

第五，建立完整的质量评价体系。

除多肽偶联效率外，还应检测脂质体粒径、PDI、Zeta电位、膜完整性及生物学功能。

实际选型时，应以瑞禧生物对应产品批次的结构信息、纯度、PEG分子量分布、储存要求及质量检测资料为准。

参考文献

1. Marqués-Gallego P, de Kroon AIPM. Ligation Strategies for Targeting Liposomal Nanocarriers. BioMed Research International. 2014;2014:129458.

2. Oswald M, et al. Determination of the activity of maleimide-functionalized phospholipids during preparation of liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 2016. PMID: 27863688.

3. Insights into maleimide-thiol conjugation chemistry: Conditions for efficient surface functionalization of nanoparticles for receptor targeting. Journal of Controlled Release. 2018.

4. Improving the stability of thiol–maleimide bioconjugates via the formation of a thiazine structure. Journal of Peptide Science. 2023.

说明： 本文为基于公开研究文献整理的技术应用文

 

建议配套的技术参数表